季 恒，葛如意，王德全，梅文杰，黃海波，周俊立，鄭士杰，石永超，汪保國，陳思東

0 引 言

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞長期接觸某一化療物后可產(chǎn)生對此種化療藥物耐藥性，而且可對其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥性。多柔比星(Doxorubicin)是乳腺癌化療的常用藥物，乳腺癌細(xì)胞的對多柔比星產(chǎn)生耐藥是多柔比星化療失敗的主要原因［1］，也是影響臨床腫瘤患者預(yù)后的重要因素［2］。乳腺癌是排名第一的女性常見惡性腫瘤，尋找克服乳腺癌MDR的藥物或方法成為當(dāng)前腫瘤研究的熱點［3］。目前研究發(fā)現(xiàn)MDR的有效抑制劑有維拉帕米、環(huán)孢素A、三苯氧胺、類固醇激素［4-6］等，但這些耐藥逆轉(zhuǎn)劑干擾傳統(tǒng)的抗癌藥物藥代動力學(xué)，且由于可引起嚴(yán)重的毒副作用等，至今都未取得預(yù)期的臨床效果，因此在臨床上被限制使用。尋找低毒高效且與合用的抗腫瘤藥物無藥動學(xué)交互作用的抑制劑，以提高藥物的利用度，避免和降低藥物的不良反應(yīng)在指導(dǎo)臨床抗腫瘤個體化治療方面具有重要意義，同時也是當(dāng)前腫瘤耐藥性研究中的重要發(fā)展方向。

西地那非(Sildenafil)，又譯昔多芬，是一種研發(fā)治療心血管疾病藥物時意外發(fā)現(xiàn)的治療男性勃起功能障礙藥物。已有研究發(fā)現(xiàn)5型磷酸二酯酶抑制劑西地那非［7］和伐地那非［8］能逆轉(zhuǎn) P-gp蛋白介導(dǎo)的MDR。同時也有研究發(fā)現(xiàn)西地那非和伐地那非可逆轉(zhuǎn)MDR相關(guān)蛋白7(MRP7)介導(dǎo)的紫杉醇耐藥［9］。本研究所用藥物是西地那非的同系物，由本實驗室指導(dǎo)廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院實驗室合成的新型化合物，擁有獨(dú)立的知識產(chǎn)權(quán)。本研究旨在通過觀察藥物處理后MCF-7/ADR和MCF-7細(xì)胞株的生長抑制率、Rhodamine123濃度，探討西地那非同系物體外實驗的安全性極其逆轉(zhuǎn)乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥性的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 實驗所用MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞株由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院惠贈;其中MCF-7/ADR細(xì)胞株是通過濃度遞增的多柔比星反復(fù)間歇誘導(dǎo)獲得，對多柔比星耐藥，而MCF-7細(xì)胞則為敏感細(xì)胞株。

1.2 藥物和器材 本研究所用藥物是由廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院實驗室合成的新型化合物，化學(xué)物結(jié)構(gòu)式見圖1(自編號XDNF1-0425和XDNF8-0113)，其電噴霧質(zhì)譜(ESI-Ms)分別為m/z412.3(［M+H］+)和m/z331.3(［M+H］+);西地那非單體由圣約翰大學(xué)陳哲生教授惠贈;多柔比星、MTT、Rhodaminel23均購于美國Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，倒置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MCF-7/ADR于含10%胎牛血清和青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 U/mL)的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)(37℃、5%CO2)。實驗前在無藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周。細(xì)胞隔日換1次培養(yǎng)液，每隔3、4天傳代1次。

圖1 XDNF1-0425、XDNF8-0113和西地那非結(jié)構(gòu)圖Figure 1 Structural formulas of XDNF1-0425，XDNF8-0113 and sildenafil

1.4 MTT法檢測細(xì)胞毒性實驗

1.4.1 MTT 法［10］測定2種西地那非同系物體外實驗的安全濃度 取對數(shù)生長期MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞進(jìn)行種板(8000細(xì)胞/孔)，CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的XDNF1-0425和XDNF8-0113(1、10、100、1000 μmol/L)，不加藥物的為陰性對照組，只加培養(yǎng)基的為調(diào)零組，每組設(shè)3個復(fù)孔;繼續(xù)培養(yǎng)68 h后加入10 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)4h后酶標(biāo)儀(波長570nm)檢測吸光值(A)，并繪制藥物濃度與細(xì)胞生存率曲線圖。

細(xì)胞生存率 =A加藥組/A對照組×100%

1.4.2 MTT法測定2種西地那非同系物對MCF-7/ADR耐藥的逆轉(zhuǎn)作用 采用上述方法將準(zhǔn)備好的MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞分組種板，每組設(shè)3個復(fù)孔。24 h后加藥，共分5組:①只加培養(yǎng)基的調(diào)零組;②不加藥物只加細(xì)胞的陰性對照組;③多柔比星組:按濃度梯度分別加入多柔比星(0.01、0.03、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0 μmol/L)，每孔 10 μL;④多柔比星+藥物組:XDNF1-0425和XDNF8-0113分別以無毒劑量(2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)與多柔比星共同加入;⑤多柔比星+西地那非組:不同濃度的西地那非(2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L)與多柔比星共同加入。CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)68 h后常規(guī)MTT比色法測定和記錄各孔A值，并計算抑制率、半抑制率(IC50)以及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。IC50通過線性回歸分析計算，細(xì)胞抑制率和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)公式計算如下:

1.5 細(xì)胞內(nèi)Rhodamine123累積實驗 取對數(shù)生長期MCF-7和MCF-7/ADR細(xì)胞種于6孔板加入不同濃度 XDNF1-0425 和 XDNF8-0113(10.0、20.0 μmol/L)，CO2的培養(yǎng)箱孵育24h后收獲。用胰酶制成細(xì)胞懸液并分組裝致8個離心管:①調(diào)零組(只加細(xì)胞懸液);②陰性對照組(細(xì)胞中只加入含有10 mg/mL 的 Rhl23);③XDNF1-0425(10 μmol/L)+Rhodamine123 組;④ XDNF1-0425(20 μmol/L)+Rhodamine123 組;⑤XDNF8-0113(10 μmol/L)+Rhodamine123 組;⑥ XDNF8-0113(20 μmol/L)+Rhodamine123 組;⑦西地那非(10 μmol/L)+Rhodamine123組;⑧西地那非(20 μmol/L)+Rhodamine123組;各組細(xì)胞在37℃條件下振蕩溫育60 min，離心后預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2遍，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity)，Ex 488nm，Em 530 nm，檢測藥物對細(xì)胞內(nèi)Rhodamine 123含量的影響。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩組間多重比較用LSD檢驗，僅對兩組均數(shù)的比較用Student's t檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2種西地那非同系物的安全濃度 測定XDNF1-0425和 XDNF8-0113對細(xì)胞株 MCF-7和MCF-7/ADR的細(xì)胞毒性作用，結(jié)果見圖2。XDNF1-0425和XDNF8-0113對細(xì)胞株的IC50均＞100 μmol/L，在20 μmol/L濃度時細(xì)胞存活率均＞90%，因此后續(xù)實驗選用2.5、5、10 和20 μmol/L 4 個濃度的XDNF1-0425和XDNF8-0113對人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。

圖2 XDNF1-0425和XDNF8-0113對細(xì)胞株 MCF-7和MCF-7/ADR的生長抑制作用Figure 2 Inhibitory effects of DNF1-0425 and XDNF8-0113 atdifferentconcentrations on MCF-7 and MCF-7/ADR cells

2.2 XDNF1-0425和 XDNF8-0113對 MCF-7/ADR耐藥的逆轉(zhuǎn)作用 MTT結(jié)果顯示在單獨(dú)加入多柔比星的對照組中MCF-7和MCF-7/ADR2種細(xì)胞株的 IC50分別為(0.15 ±0.08)μmol/L 和(17.63 ±1.73)μmol/L，可見 MCF-7/ADR 細(xì)胞對多柔比星耐藥(耐藥倍數(shù)為117.5);XDNF1-0425各濃度組干預(yù)后多柔比星對MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50分別下降至(13.05 ±0.56)、(7.80 ±1.57)、(2.77 ±0.77)、(1.49 ±0.69)μmol/L，多柔比星對 MCF-7/ADR細(xì)胞的IC50在多柔比星+XDNF1-0425各濃度組較多柔比星組明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或 P ＜ 0.01)，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為分別為 1.35、2.26、6.36和11.83倍，見表1。但多柔比星對MCF-7細(xì)胞的IC50與XDNF1-0425的加入與否其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);XDNF8-0113各濃度組干預(yù)后所得的IC50值與單用多柔比星組比較有明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或 P＜0.01)，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為分別為 1.04、2.09、5.58、13.47 倍，見表 1。研究表明XDNF1-0425和XDNF8-0113能有效逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADM細(xì)胞對多柔比星的耐藥性，且在一定濃度范圍內(nèi)XDNF1-0425和XDNF8-0113的濃度與逆轉(zhuǎn)效果成正比。作為對照組單用西地那非與多柔比星處理后逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為分別為3.72、8.26、15.44、24.83 倍。

表1 XDNF1-0425和XDNF8-0113逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞對多柔比星的耐藥性(±s，μmol/L)Table 1 Effects of sildenafil homologues on the sensitivity of MCF-7 and MCF-7/ADR cells to Doxorubicin(±s，μmol/L)

表1 XDNF1-0425和XDNF8-0113逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞對多柔比星的耐藥性(±s，μmol/L)Table 1 Effects of sildenafil homologues on the sensitivity of MCF-7 and MCF-7/ADR cells to Doxorubicin(±s，μmol/L)

與多柔比星組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01

IC組 別50逆轉(zhuǎn)倍數(shù)多柔比星組MCF-7/ADR 17.63 ±1.73 1.00多柔比星+西地那非組2.5 μmol/L 4.74 ±1.04＊＊ 3.72 5.0 μmol/L 2.13 ±0.97* 8.26 10.0 μmol/L 1.14 ±0.77* 15.44 20.0 μmol/L 0.71 ±0.69＊＊ 24.83多柔比星+XDNF1-0425組2.5 μmol/L 13.05 ±0.56＊＊ 1.35 5.0 μmol/L 7.80 ±1.57* 2.26 10.0 μmol/L 2.77 ±0.77* 6.36 20.0 μmol/L 1.49 ±0.69＊＊ 11.83多柔比星+XDNF8-0113組2.5 μmol/L 16.48 ±0.86* 1.04 5.0 μmol/L 8.24 ±1.23＊＊ 2.09 10.0 μmol/L 3.09 ±0.91* 5.58 20.0 μmol/L 1.28 ±0.44＊＊13.47

2.3 細(xì)胞內(nèi)Rhodamine123累積實驗 Rhodamine 123是一種特異性的P-gp蛋白熒光底物，通過細(xì)胞內(nèi)Rhodamine 123的蓄積來反映藥物抑制P-gp蛋白活性的效率，表現(xiàn)為測得的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。經(jīng) 10 和 20 μmol/L XDNF1-0425 和 XDNF8-0113處理后的MCF-7/ADR細(xì)胞，Rhodamine l23熒光波峰右移，見圖3，且在一定濃度范圍內(nèi) XDNF1-0425、XDNF8-0113和西地那非能夠抑制MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)Rhodamine123的外排，見表2;提示XDNF1-0425和XDNF8-0113可抑制MCF-7/ADR細(xì)胞P-gp蛋白的外排功能，增加Rhodamine 123在細(xì)胞內(nèi)的蓄積。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Rhodamine 123熒光強(qiáng)度Figure 3 Rhodamine 123 retention analyzed by FCM

表2 MCF-7/ADM細(xì)胞中不同濃度西地那非及其同系物對Rhodamine 123外排的抑制作用(±s)Table 2 Inhibitory effects sildenafil and its homologues on rhodamine 123 efflux in MCF-7/ADM cells(±s)

表2 MCF-7/ADM細(xì)胞中不同濃度西地那非及其同系物對Rhodamine 123外排的抑制作用(±s)Table 2 Inhibitory effects sildenafil and its homologues on rhodamine 123 efflux in MCF-7/ADM cells(±s)

外排抑制率=(經(jīng)藥物處理的熒光強(qiáng)度-陰性對照組的熒光強(qiáng)度)/陰性對照組的熒光強(qiáng)度×100%與陰性對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01

組 別 平均熒光強(qiáng)度(n=3) 外排抑制率(%)2.14 ±0.15 -XDNF1-0425組10.0μmol/L 2.53 ±0.09 18.35±2.31*20.0μmol/L 2.74 ±0.17 27.83±1.43＊＊XDNF8-0113組10.0μmol/L 2.49 ±0.24 16.67±0.57＊＊20.0μmol/L 2.77 ±0.09 29.48±1.93*西地那非組10.0μmol/L 2.57 ±0.35 20.21±0.94＊＊20.0μmol/L 2.97 ±0.15 38.57±2.86陰性對照組＊＊

3 討 論

MDR是目前影響腫瘤患者化療成功的一個主要因素，隨著對MDR現(xiàn)象及其機(jī)制的不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)MDR的產(chǎn)生不是由單一因素引起的，而是多種機(jī)制共同參與作用的結(jié)果，包括腫瘤細(xì)胞凋亡逃避、DNA損傷后修復(fù)能力增強(qiáng)、抗癌藥物作用分子靶點發(fā)生改變、抗癌藥物代謝酶活性增強(qiáng)［11］、藥物攝取降低以及進(jìn)入內(nèi)藥物被主動轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外［12］等。近年來，關(guān)于天然提取物對腫瘤細(xì)胞MDR的研究成為熱點，國外有學(xué)者使用米非司酮(Mifepristone)對卵巢癌耐藥細(xì)胞株進(jìn)行體外細(xì)胞毒性試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 μmol/L的米非司酮對細(xì)胞生長無影響，但使用該劑量的米非司酮能成功逆轉(zhuǎn)該細(xì)胞對多種抗癌藥的耐藥性［13］。本次實驗經(jīng)過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)10.0 μmol/L 和 20.0 μmol/L 濃度的西地那非同系物的逆轉(zhuǎn)效果較好。Elizabeth和Alica［14］在米非司酮對耐多柔比星人乳腺癌細(xì)胞MCF-7/ADR體內(nèi)外耐藥逆轉(zhuǎn)作用中試驗中測得MCF-7/ADR細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為41倍。本實驗中MCF-7/ADR細(xì)胞的耐藥倍數(shù)為117.5倍，說明不同實驗當(dāng)中建立的耐藥細(xì)胞體系存在較大差異，可能是由于原代細(xì)胞株對化療藥的敏感性不同和所用藥物抗癌效力不同導(dǎo)致。本實驗中 XDNF1-0425 在 10.0 μmol/L 和20.0 μmol/L時與多柔比星合用時MCF-7/ADR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為6.36和11.83倍;而XDNF8-0113在10.0 μmol/L 和 20.0 μmol/L 時與多柔比星合用時對MCF-7/ADR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為5.58和13.47倍，提示XDNF1-0425和XDNF8-0113具有較好的逆轉(zhuǎn)作用;且在一定濃度范圍內(nèi) XDNF1-0425和 XDNF8-0113的逆轉(zhuǎn)效果隨濃度的增高而增強(qiáng)。同時作為對照組的西地那非也具有較強(qiáng)的逆轉(zhuǎn)效果，其在10.0 μmol/L 和 20.0 μmol/L 時與多柔比星合用時對MCF-7/ADR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為15.44和24.83倍;雖然本實驗所用西地那非同系物的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)小于西地那非，但是其較小的副作用作為抗腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)劑仍然具有很重要的臨床意義。

實驗所選的人乳腺癌MDR細(xì)胞株MCF-7/ADR高表達(dá)P-gp蛋白［15］，P-gp蛋白是一種 ATP依賴性的跨膜外流泵，它可通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)多種抗腫瘤藥，從而限制這些抗腫瘤藥進(jìn)入細(xì)胞而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥，因此介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多柔比星、長春新堿等藥物的耐藥［16］。我們推測 XDNF1-0425和 XDNF8-0113逆轉(zhuǎn)作用機(jī)制可能是抑制P-gp蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞外排作用，并通過流式細(xì)胞術(shù)證實10.0 μmol/L和20.0 μmol/L 的 XDNF1-042 和 XDNF8-0113 可以抑制MCF-7/ADR細(xì)胞P-gp蛋白的外排功能，從而實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞的耐藥性。

綜上所述，人乳腺癌MCF-7/ADR細(xì)胞對多柔比星耐藥，而西地那非同系物XDNF1-0425和XDNF8-0113對其耐藥性有顯著的逆轉(zhuǎn)作用，并且可抑制其P-gp糖蛋的外排功能。其逆轉(zhuǎn)作用在蛋白表達(dá)及基因調(diào)控方面的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

［1］ Detwiler A，Bloom P，Petersen A，et al.Multi-drug and methicillin resistance of staphylococci from canine patients at a veterinary teaching hospital(2006-2011)［J］.Vet Q，2013，32(2):60-67.

［2］ 陳一天，封 冰，陳龍邦.小細(xì)胞肺癌化療耐藥研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2012，25(5):515-519.

［3］ 趙善鵬，于澤平，顧 軍，等.乳腺癌組織中BRCA1的蛋白表達(dá)與乳腺癌的相關(guān)性分析研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2011，24(10):1049-1053.

［4］ Goncalves RS，Kaiser CR ，Lourenco MC，et al.Mefloquine-oxazolidine derivatives，derived from mefloquine and arenecarbaldehydes:In vitro activity including against the multidrug-resistant tuberculosis strain T113［J］.Bioorg Med Chem，2012，20(1):243-248.

［5］ Zhang Z，Liu Z，Ma L，et al.Reversal of multidrug resistance by mitochondrial targeted self-assembled nanocarrier based on stearylamine［J］.Mol Pharm，2013，10(6):2426-2434.

［6］ Zhang LH，Wei EQ.ONO-1078 reduces NMDA-induced brain injury and vascular celladhesion molecule-1 expression in rats［J］.Acta Pharmacol Sin，2005，26(4):435-440.

［7］ Shi Zhi，Tiwari AK，Shukla S，et al.Sildenafil reverses ABCB1 and ABCG2-mediated chemotherapeutic drug resistance［J］.Cancer Res，2011，71(8):3029-3041.

［8］ Ding PR，Tiwari AK，Ohnuma S，et al.The phosphodiesterase 5 inhibitor vardenafil is a potent inhibitor of ABCB1/P-glycoprotein transporter［J］.PLoS One，2011，6(4):e19329.

［9］ Chen JJ，Sun YL，Tiwari AK，et al.PDE5 inhibitors，sildenafil and vardenafil，reverse multidrug resistance by inhibiting the efflux function of multidrug resistance protein7(ATP-binding Cassette C10)transporter［J］.Cancer Sci，2012，103(8):1531-1537.

［10］ 唐 琛，韓 克.性激素與促性腺激素對卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外生長調(diào)控及其機(jī)制的研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2012，25(12):1238-1241.

［11］ 羅春英，王 璇，時姍姍，等.非小細(xì)胞肺癌化療藥物敏感基因表達(dá)及其臨床病理特征分析［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2013，26(5):481-484.

［12］ Kuang YH，Shen T，Chen X，et al.Lapatinib and erlotinib are potent reversal agents for MRP7(ABCC1)-mediated multidrug tesistance［J］.Biochem pharmacol，2010，79(2):154-161.

［13］ Carbonell Esteve JL.Aeosta R，Heredia B，et al.Mifepristone for thet treatment of uterinel leiomyonms:a randomized controlled trial［J］.Obstet Gynecol，2008，112(5):1029-1036.

［14］ Elizabeth MF，Alica AG.Sistance to cisplatin does not affect sensitivity of human ovarian cancer cell lines to mifepristone eytotoxieity［J］.Cancer Cell International，2009，9(4):1-13.

［15］ Carson SW，Ousmanou AD，Hoyler SL.Emerging significance of P-glycoprotein in understanding drug disposition and drug interactions in psychopharmacology［J］.Psychopharmacol Bull，2002，36(1):67-81.

［16］ Ma H ，Miao X ，Ma Q，et al.Functional roles of glycogene and N-glycan in multidrug resistance of human breast cancer cells［J］.IUBMB Life，2013，2(31):108-123.