鮑文華，梁建合，李樹民，孫云暉，閻紅娥

0 引 言

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種不明原因引起進(jìn)展性肺實(shí)質(zhì)組織纖維疤痕化和肺功能不可逆性喪失的慢性肺疾病，多發(fā)于老年人。其發(fā)病率和病死率日漸增高，全球已超過500萬人肺部呈現(xiàn)出不同程度PF，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難，終末期常死于呼吸衰竭，確診后的患者平均生存時(shí)間為2～4年，其五年生存率為30%～50%［1］。目前，IPF發(fā)病機(jī)制仍未明確，尚缺乏有效的診治措施。Raghu等［2］研究證實(shí)，在肺纖維化過程中多種炎癥因子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Th17細(xì)胞是一種獨(dú)特效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群，介導(dǎo)多種慢性炎癥、自身免疫性疾病和腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3］。本研究的前期工作發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞及部分相關(guān)因子參與IPF的發(fā)病機(jī)制［4-5］。故本研究旨在檢測大鼠PF模型Th17細(xì)胞、IL-23R以及血清IL-17含量的動(dòng)態(tài)表達(dá)，探討Th17細(xì)胞和IL-23/IL-17軸在PF發(fā)病中的作用，從而為臨床診斷和治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠63只，體重(210±20)g，清潔級(jí)，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物合格證號(hào) ISCXK(遼)2008-0002］，按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)正常飼養(yǎng)。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 注射用鹽酸博來霉素(日本化藥株式會(huì)社)、一抗:IL-23R單克隆抗體(美國abcam公司)、二抗SP試劑盒、DAB顯色試劑盒、羥脯氨酸試劑盒 、IL-17 ELISA試劑盒均購于天津市金圣生物試劑公司;小鼠抗大鼠單克隆流式抗體APC Mouse Anti-Rat CD3、PerCP Mouse Anti-Rat CD8a、抗小鼠/大鼠單克隆抗體Anti-Mouse/Rat IL-17A FITC及同型對(duì)照、固定/破膜劑、Lysing Buffer溶血素(美國BD Pharmingen公司)均購于北京利文公司;膠原酶Ⅴ、離子霉素、PMA(美國Sigma公司)均購于北京利文公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組和模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組(對(duì)照組)、肺纖維化模型組(模型組)及地塞米松干預(yù)組(地塞米松組)，每組21只。各組大鼠使用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)行腹腔注射麻醉后，仰臥于鼠板上固定，頸部備皮，常規(guī)消毒，剪開頸部正中皮膚，鈍性分離暴露氣管，保證氣道通氣，取兩軟骨環(huán)間穿刺，約到氣管分叉處，模型組、地塞米松組快速推注入博來霉素(0.5 mg/100 g)，對(duì)照組氣管內(nèi)注入等滲鹽水。向氣管內(nèi)再次注入0.2 mL的空氣2～3次，立即將其直立，以身體長軸為中心，快速正反旋轉(zhuǎn)鼠板1～2min，使藥物在兩肺內(nèi)分布均勻，縫合皮膚，動(dòng)物室飼養(yǎng)。地塞米松組次日開始，每天行地塞米松注射液(0.3 mg/100 g)腹腔注射，對(duì)照組、模型組使用等滲鹽水腹腔注射。

1.2.2 動(dòng)物的處死和標(biāo)本采集 各組大鼠分批于第7、14、28天，隨機(jī)取7只大鼠，行眶后動(dòng)脈放血處死。收集外周血1 mL，離心(3000 r/min、15 min、離心半徑10 cm)，留取血清，用于IL-17檢測;心肺分離，留取肺組織，取右上肺行固定、脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色法觀察肺組織病理的動(dòng)態(tài)變化和免疫組化法評(píng)估IL-23R的表達(dá);取右中下肺約100 mg，置Ep管內(nèi)，-70℃保存，檢測肺組織中HYP;留取左上肺50 mg，制備單細(xì)胞懸液，檢測肺組織Th17細(xì)胞百分率。

1.2.3 外周血IL-17及肺組織HYP含量檢測 分別采用ELISA法和堿水解法檢測外周血IL-17及肺組織HYP含量，嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 肺組織IL-23R表達(dá)水平 采用免疫組織化學(xué)法評(píng)估，依次通過切片、脫蠟、水化、消除內(nèi)源性過氧化物酶活性、抗原修復(fù)后，加血清封閉液孵育，滴加一抗過夜，PBS沖洗，加入二抗孵育，PBS沖洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。陽性組織切片:細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒;陰性組切片:細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無棕黃色反應(yīng)物，細(xì)胞核為藍(lán)色。400倍顯微下照相，使用image proplus細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)對(duì)每張切片陽性染色的平均灰度值進(jìn)行評(píng)分，具體標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)［6-7］。

1.2.5 肺單細(xì)胞懸液制備 參照文獻(xiàn)［8-9］采用膠原酶Ⅴ消化法制備，取左肺約50 mg，超凈工作臺(tái)內(nèi)，無菌PBS清洗肺組織后，眼科剪將肺組織剪成0.5～1 mm3小塊，然后采用消化法(膠原酶Ⅴ消化液)將組織制成肺單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)1.0 ～3.0 ×107個(gè)/L。

1.2.6 CD3+CD8-IL-17+Th17細(xì)胞檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測，用RPMI-1640培養(yǎng)基將肺組織單細(xì)胞懸液濃度調(diào)整到1～2×106個(gè)/mL，然后依次加入(PMA、離子霉素、BFA)刺激劑 ，孵育(37℃、5%CO2、5 h)，胞外染色(CD8 和 CD3 抗體)，溶血，破膜通透，胞內(nèi)染色(IL-17 PE)。上機(jī)檢測:加入0.5 mL的鞘液，在CellQuest軟件下，獲取10萬個(gè)細(xì)胞。應(yīng)用BD FACS Aria流式細(xì)胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用單因素方差分析和組間多重比較，方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊采用Games-Howell檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肺組織病理學(xué)變化 大體標(biāo)本觀察對(duì)照組大鼠兩肺為淡紅色、質(zhì)軟、肺表面富有彈性，無腫脹和出血點(diǎn)。模型組、地塞米松組第7天兩肺出現(xiàn)明顯水腫，可見點(diǎn)狀或片狀出血灶;第14天兩肺腫脹部分消退，為灰白色，質(zhì)較實(shí)硬，彈性較差，肺表面可見灰白色小斑塊;第28天兩肺體積有所縮小，腫脹消退，質(zhì)地硬，為蒼白色，肺表面出現(xiàn)結(jié)節(jié)樣和條索狀病灶。在相同時(shí)間點(diǎn)上，地塞米松組大鼠肺組織病變程度及范圍較模型組明顯減輕。

光鏡觀察對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整。模型組大鼠第7天可見大量炎癥灶，肺泡腔及間隔內(nèi)浸潤大量中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，肺泡萎縮，肺泡間隔增寬且水腫，肺毛細(xì)血管充血，成纖維細(xì)胞增多;第14天大鼠肺組織肺實(shí)質(zhì)炎癥較前有所吸收，仍有較明顯炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)部分喪失，膠原纖維增生和成纖維細(xì)胞增殖，造成肺泡間隔進(jìn)一步的增寬;第28天肺實(shí)質(zhì)炎癥基本吸收，少量炎性細(xì)胞浸潤，可見肺泡壁斷裂腔，肺泡結(jié)構(gòu)破壞、消失，肺泡間隔內(nèi)大量纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維沉積，導(dǎo)致肺泡隔顯著增厚，纖維組織為瘢痕條索樣改變。地塞米松組與模型組病理變化基本相同。同一時(shí)間點(diǎn)相比，其炎癥細(xì)胞的浸潤及纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維增生程度輕于模型組。見圖1。

2.2 各組大鼠肺組織中HYP含量的變化 模型、地塞米松組的HYP含量在各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，第7天開始升高，第28天到達(dá)高峰;在不同時(shí)間點(diǎn)，地塞米松組數(shù)值低于同期模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。具體結(jié)果見表1。

2.3 各組大鼠外周血中IL-17的變化 與對(duì)照組相比，模型、地塞米松組外周血IL-17水平在各時(shí)間點(diǎn)顯著增高(P＜0.05)，且在第7天達(dá)到高峰后后逐漸降低，第28天時(shí)仍高于對(duì)照組。與同期模型組外周血IL-17含量相比較，地塞米松組含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.4 各組大鼠肺組織 CD4+、IL-17+、Th17細(xì)胞和IL-23R的表達(dá) 模型組在不同時(shí)間點(diǎn)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，數(shù)值以第7天最高，且呈逐漸降低的趨勢，第28天時(shí)仍高于對(duì)照組。地塞米松組與模型組表現(xiàn)出相同的變化趨勢，低于同期模型組、高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 3、表 4。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色鏡下所見(×200)Figure 1 HE staining of pulmonary tissues in each group(×200)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中HYP含量的比較(±s，μg/mg)Table 1 Comparison of HYP contents in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，μg/mg)

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中HYP含量的比較(±s，μg/mg)Table 1 Comparison of HYP contents in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，μg/mg)

與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

組別 n HYP第7天 第14天 第28天7 1.13 ±0.04 1.12 ±0.03 1.12 ±0.03模型組 7 1.65 ±0.03* 30.72 ±1.51* 43.38 ±2.32*地塞米松組 7 1.56 ±0.04*#22.54 ±1.44*# 32.09 ±1.06*#對(duì)照組

表2 IL-17在各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中的水平(x ± s，pg/mL)Table 2 Levels of IL-17 in serum of rats in each group at different time points(±s，pg/mL)

表2 IL-17在各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中的水平(x ± s，pg/mL)Table 2 Levels of IL-17 in serum of rats in each group at different time points(±s，pg/mL)

與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

組別 n IL-17第7天 第14天 第28天7 7.40 ±0.37 7.41 ±0.36 7.41 ±0.38模型組 7 54.04 ±1.52* 34.22 ±1.31* 24.58 ±1.23*地塞米松組 7 39.22 ±1.38*#28.28 ±1.26*# 18.63 ±1.12*#對(duì)照組

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中的CD4+IL-17+Th17細(xì)胞百分率(±s，%)Table 3 Ratio of CD4+IL-17+Th17cell in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，%)

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中的CD4+IL-17+Th17細(xì)胞百分率(±s，%)Table 3 Ratio of CD4+IL-17+Th17cell in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，%)

與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

組別 n CD4+IL-17+Th17第7天 第14天 第28天7 0.79 ±0.05 0.79 ±0.02 0.79 ±0.03模型組 7 9.60 ±0.43* 6.62 ±0.28* 4.40 ±0.22*地塞米松組 7 8.63 ±0.32*# 4.99 ±0.25*# 3.28 ±0.18*#對(duì)照組

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中IL-23R的表達(dá)(±s，%)Table 4 Expression of IL-23R in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，%)

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肺組織中IL-23R的表達(dá)(±s，%)Table 4 Expression of IL-23R in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，%)

與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與模型組比較，#P＜0.05

組別 n IL-23R第7天 第14天 第28天7 31.21 ±2.16 30.81 ±2.02 30.27 ±2.23模型組 7 189.37 ±11.43* 167.26 ±9.52* 108.33 ±6.13*地塞米松組 7 154.13 ±10.28*#127.01 ±8.64*# 84.07 ±5.63*#對(duì)照組

3 討 論

PF是間質(zhì)性肺疾病的終末結(jié)局，其病理變化表現(xiàn)為肺泡上皮細(xì)胞的損傷、肺泡結(jié)構(gòu)破壞和過度纖維組織增殖的動(dòng)態(tài)過程［10］。有文獻(xiàn)報(bào)道，肺內(nèi)HYP含量與膠原含量是具有確切的數(shù)量關(guān)系，而肺成纖維細(xì)胞是合成膠原的主要細(xì)胞，因此肺組織中HYP含量變化可以反應(yīng)肺組織纖維化程度［10］。觀察本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺組織病理變化，早期以肺泡炎癥改變?yōu)橹鳎梢娧装Y細(xì)胞大量浸潤，成纖維細(xì)胞略有增多;晚期則以肺間質(zhì)纖維化為主，可見炎癥吸收，炎性細(xì)胞浸潤較前明顯減少，成纖維細(xì)胞顯著增生，肺泡萎縮或消失;HYP含量呈現(xiàn)出逐漸升高的變化趨勢。提示用BLM制備PF模型成功。

目前，細(xì)胞因子參與PF過程中機(jī)制的研究日益成為熱點(diǎn)。有學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞因子調(diào)控失衡是造成PF的基礎(chǔ)，尤其是Th1/Th2型細(xì)胞因子失衡起到主要作用。但近年來，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明起到關(guān)鍵作用的可能并不是 Th1/Th2型細(xì)胞因子［11-13］。Th17細(xì)胞是由在TGF-β和 IL-6作用下活化的初始T細(xì)胞分化而來的一個(gè)獨(dú)立特殊CD4+T細(xì)胞亞型［14-15］，其分化調(diào)節(jié)與IL-23密切相關(guān)，且分泌特征性炎癥細(xì)胞因子IL-17［16］，表達(dá)趨化因子受體6及IL-23R。作為一類介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要效應(yīng)T細(xì)胞，與Th1、Th2輔助細(xì)胞以及T調(diào)節(jié)細(xì)胞3種傳統(tǒng)的CD4+T細(xì)胞亞群具有不同的細(xì)胞生物學(xué)和分化調(diào)節(jié)功能［17-18］，通過IL-23/IL-17軸在介導(dǎo)宿主防御和自身免疫性疾病及變態(tài)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［19］。IL-23是一種促炎細(xì)胞因子，并不能直接誘導(dǎo)原始T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，由于IL-23R僅表達(dá)于激活和/或記憶的T細(xì)胞，初始 Th17祖細(xì)胞并不表達(dá)，而IL-23必須與其受體IL-23R結(jié)合后以介導(dǎo)激活的記憶T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17，其是Th17細(xì)胞維持、增殖的重要因子［20］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在BLM誘導(dǎo)的PF大鼠模型中，肺組織Th17、IL-23R和外周血IL-17水平明顯升高，尤其以肺泡炎時(shí)最為顯著。提示Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子IL-23R、IL-17參與肺組織肺泡炎和肺纖維化過程，尤其是在PF早期肺泡炎階段，這與相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同［21］。其機(jī)制可能為BLM造成大鼠肺組織損傷，產(chǎn)生肺泡炎，導(dǎo)致大量的炎癥細(xì)胞招募至炎性病灶釋放大量炎癥因子，其中TGF-β和 IL-6可誘導(dǎo)初始T向Th17細(xì)胞分化，在IL-23和IL-21協(xié)同下，調(diào)高IL-23R在Th17細(xì)胞表面的表達(dá)，IL-23通過與其受體結(jié)合后，JAK-STAT信號(hào)途徑被激活，磷酸化的分子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3介導(dǎo)Th17的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt高表達(dá)，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞分泌IL-17和增強(qiáng)在體內(nèi)的穩(wěn)定和擴(kuò)增。IL-17則誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞參與前炎癥反應(yīng)，放大致炎效應(yīng)，同時(shí)還可以介導(dǎo)與組織纖維化密切相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-6、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子和肝細(xì)胞生長因子等)高表達(dá)，從而參與到肺組織纖維化過程。Th17、IL-17與 PF有關(guān)，由 Dubin等［22］首次提出。在研究肺的囊性纖維化過程中，他們發(fā)現(xiàn)當(dāng)囊性纖維化急性發(fā)作時(shí)，T細(xì)胞、Th17、IL-17A、IL-23在小鼠支氣管肺泡灌洗液和痰中的濃度明顯升高，給予抗炎干預(yù)后均有下降;Tan等［23］進(jìn)一步證實(shí)囊性纖維化患者支氣管肺泡灌洗液中CD4+T、IL-17 呈高水平表達(dá)。Decraene等［24］通過在評(píng)估PF患者痰液中的IL-17A、IL-23 mRNA表達(dá)及蛋白水平，證實(shí)了IL-23、IL-17A參與PF的炎癥及病理發(fā)展過程，并發(fā)揮重要作用。

值得注意在本研究中注射BLM后第2天，給予地塞米松抗炎治療后，Th17、IL-23R和IL-17表達(dá)量在同一時(shí)間點(diǎn)與模型組相比均顯著下降，HYP增高和PF程度減弱，且三者在不同時(shí)間點(diǎn)變化趨勢相同，提示地塞米松可能通過干擾IL-23/IL-17炎癥軸某個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，抑制Th17表達(dá)IL-17，但與同期的對(duì)照組相比具有顯著差異，故并不能排除有其他機(jī)制在發(fā)揮作用。

總之，PF大鼠模型肺組織TH17細(xì)胞、IL-23R和血清IL-17表達(dá)增高，并與肺部炎癥、PF程度密切相關(guān)，提示其可能參與PF形成過程，其確切的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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