王小剛 , 駱 劍 尹紹武, 陳國華

(1. 海南大學(xué) 海洋學(xué)院 熱帶生物資源教育部重點實驗室, 海南 ?？?570228; 2. 海南省農(nóng)業(yè)干部學(xué)校, 海南 海口 571100; 3. 南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京 210023)

點帶石斑魚(Epinephelus malabaricus)屬鱸形目(Perciformes)、 科(Serranidae)、石斑魚亞科(Epinephelinae)、石斑魚屬(Epinephelus)。該魚具有分布廣、 生長快 、肉質(zhì)鮮美等特點, 是中國東南沿海重要的名貴海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚種, 是海南省海水養(yǎng)殖中數(shù)量較大、較普遍的魚種[1-2]。

魚類精液超低溫保存在水產(chǎn)養(yǎng)殖、遺傳育種及種質(zhì)資源保存中具有很重要意義: 魚類精液的超低溫冷凍保存, 不僅可以實現(xiàn)種質(zhì)材料的長距離運輸,有利于不同區(qū)域魚類的雜交、選育、獲得優(yōu)良性狀及基因多樣性保護(hù)[3]; 還可以為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和實驗生物學(xué)研究長期穩(wěn)定地提供材料。自1953年Blaxter[4]成功冷凍保存太平洋鯡魚(Clupea pallasi)精巢以來,魚類精液的超低溫冷凍保存研究已取得了巨大成就。目前, 已有200多種淡水魚類和40多種海水魚類的精液成功獲得了冷凍保存[5-6]。因海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展迫切需要及對海洋種質(zhì)資源保護(hù)的認(rèn)識, 中國對于一些具有較高經(jīng)濟(jì)價值的魚類精液進(jìn)行超低溫冷凍保存, 并取得了巨大的研究進(jìn)展, 如鯛科(Sparidae)[7-8]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[9]、鱸魚(Lateolabrax japonicus )[10]、鲆科(Bothidae)[11-12]等。而關(guān)于點帶石斑魚的精液冷凍保存的研究報道較少,鑒于點帶石斑魚在中國海水增養(yǎng)殖業(yè)中的重要經(jīng)濟(jì)地位, 因此有必要建立精子冷凍保存庫, 保存優(yōu)良的種質(zhì)資源, 這對點帶石斑魚的遺傳改良及石斑魚增養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展都具有重要的理論和現(xiàn)實意義。因此作者對繁殖季節(jié)中3個不同時期的點帶石斑魚精液進(jìn)行超低溫冷凍保存研究, 為建立點帶石斑魚精子冷凍保存庫提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考資料。

1 材料與方法

1.1 精子的采集

雄性點帶石斑魚由海南省陵水縣新村港養(yǎng)殖基地提供。點帶石斑魚繁殖季節(jié)是每年的 3月～9月, 由于點帶石斑魚產(chǎn)卵比較規(guī)律, 每月幾乎固定在相同的日期開始產(chǎn)卵。采精在親魚的產(chǎn)卵前1 d、產(chǎn)卵后1周及繁殖季節(jié)末期 9月份等 3個時期中分別取材。3～4月份采集精子的活力較好, 運動時間最長; 5～8月份采集的精子質(zhì)量下降; 9、10月份只能取到少量稀薄的點帶石斑魚精子, 且質(zhì)量很差。

從點帶石斑魚雌雄親本的混養(yǎng)網(wǎng)箱中, 選取健康、無外傷的雄性親魚30尾(體質(zhì)量5～7 kg/尾, 體長0.4～0.5 m/尾)進(jìn)行實驗。親魚經(jīng)麻醉后采用擠壓法采集精液, 用干毛巾擦干魚體生殖孔周圍的水分與黏液, 然后輕壓腹部, 擠出精液, 用準(zhǔn)備好的干凈注射器吸取精液置于冰上的1.5 mL離心管中。采精過程中要防止海水濺入和避免糞便、尿液等污染精液。

1.2 冷凍保護(hù)液配方篩選

1.2.1 稀釋液選擇

本實驗采用TS-19、TS-2、Hank’s、MPRS (Modified plaice ringer solution)、Cortland和0.75% NaCl 等6種溶液作為冷凍稀釋液(稀釋 10倍后用于實驗), 其組成成分見表1, 以濃度為15% 的DMSO (二甲亞砜)作為抗凍劑, 配置成不同稀釋液的冷凍保護(hù)液進(jìn)行最適稀釋篩選。比較6種稀釋液對精子的保護(hù)效果, 篩選出比較適宜的稀釋液。精液與冷凍保護(hù)液以 1∶30的比例混合, 樣品冷凍保存體積為 0.6 mL, 三步法降溫冷凍保存, 復(fù)溫時在液氮蒸汽中平衡10 min后, 直接40℃水浴至完全融化, 顯微鏡觀察和記錄凍精復(fù)活比例。

冷凍降溫-復(fù)溫過程:

表1 6種不同稀釋液的組成成分Tab.1 Constituent of six different extender solutions

1.2.2 抗凍液選擇

二甲亞砜(DMSO)、甘油(Gly)和甲醇(MeOH)作為抗凍液, 設(shè)置10%, 15%, 20%和25%等4個濃度梯度, 與篩選出的最佳冷凍稀釋液組合, 配置成不同濃度的冷凍保護(hù)液。比較 3種抗凍液及濃度對點帶石斑魚精子的保護(hù)效果, 篩選出最適宜的抗凍液及濃度, 得出最適宜的冷凍保護(hù)液組合配方。精液與冷凍保護(hù)液以 1∶30的比例混合, 樣品冷凍保存體積為 0.6 mL, 三步法降溫冷凍保存, 復(fù)溫時在液氮蒸汽中平衡10 min后, 直接放入40℃水浴至完全融化,顯微鏡觀察和記錄凍精復(fù)活比例。

全部實驗均重復(fù) 3次, 結(jié)果取平均值, 采用Excel和spss11.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果

2.1 點帶石斑魚精子冷凍保護(hù)液篩選

2.1.1 稀釋液選擇

根據(jù)圖1所示, 點帶石斑魚精液和6種不同稀釋液與15% DMSO配置的冷凍保護(hù)液以1∶30的比例混合, 經(jīng)三步法超低溫冷凍-復(fù)溫后, 顯微鏡觀察統(tǒng)計, 其精子復(fù)活成活率最高達(dá)到 50%以上, 明顯差于正常精子激活成活率。其中Hank’s與15% DMSO配置成的冷凍保護(hù)液, 對精子的保護(hù)效果明顯高與其他5種稀釋, 而TS-2, TS-19冷凍保護(hù)效果依次下降, 但也明顯高于MPRS, Cortland和0.75% NaCL的保護(hù)效果?？梢? Hank’s溶液可以做為點帶石斑魚精液冷凍保存最適的稀釋液。

2.1.2 抗凍液選擇

用篩選出最適宜的Hank’s溶液作為冷凍稀釋液,與 3種不同濃度的抗凍液配置冷凍保護(hù)液, 點帶石斑魚精液與冷凍保護(hù)液以1: 30的比例混合, 經(jīng)三步法冷凍-復(fù)溫后, 其精子復(fù)活成活率如表 2所示。其中 MeOH對精子的抗凍保護(hù)效果最差, 濃度 10%～25%內(nèi)變化, 精子成活率均為0%。DMSO和Gly對精子的抗凍保護(hù)效果都很好, 其冷凍-復(fù)溫后的精子成活率可達(dá) 50%以上, 精子激活效果均差于正常情況。其中10%、15% DMSO和15%～25% Gly的抗凍保護(hù)效果都非常好, 其冷凍-復(fù)溫的精子成活率高于60%以上。

圖1 稀釋液對點帶石斑魚精子凍后成活率的影響Fig.1 The effects of extender solutions on spermatozoa survival rate of E.malabaricus

2.2 抗凍液對點帶石斑魚精子的激活作用

3種不同濃度的抗凍液在冷凍前后對點帶石斑魚精子的激活效果影響, 如表3所示。點帶石斑魚精液在超低溫冷凍之前, 顯微鏡下觀察, 未加天然海水激活的情況下, 不同濃度的DMSO和MeOH均未能激活精子運動; 而不同濃度的 Gly則都可以激活精子運動, 10%～20% Gly對精子的激活效果接近與正常天然海水的效果, 激活比例達(dá)80%以上。但是加入天然海水后, 不同濃度的DMSO和MeOH均被激活精子運動, 激活效果接近與正常天然海水的效果,激活比例達(dá)80%以上; 而Gly的激活效果急劇下降至5%以內(nèi)。精液經(jīng)超低溫保存后, 未加海水情況下, 不同濃度的DMSO和MeOH均未能激活精子運動; 不同濃度的Gly相比冷凍前, 精子激活比例有下降, 15%Gly的激活比例能達(dá)60%以上。加海水后, 不同濃度的DMSO對精子激活比例均高于Gly和MeOH, 10%和15% DMSO的激活比例達(dá)60%以上; 而Gly和MeOH的效果很差, Gly偶能見到運動的精子, 但不同濃度的MeOH均未看到激活運動的精子, 且凍存管明顯出現(xiàn)乳白色的黏稠的絮狀物質(zhì)。同時實驗中觀察到, 不同濃度的 Gly在未加海水激活的情形下, 精子均能被 Gly激活運動, 加海水激活后, 精子運動激活比例急劇下降。因此, 10%～15%DMSO為最適抗凍液濃度范圍。

表2 抗凍液對點帶石斑魚凍后精子成活率的影響Tab.2 The effects of cryopreservation on spermatozoa survival rate of E.malabaricus

表3 抗凍液對點帶石斑魚精子的激活影響Tab.3 The effects of cryopreservation on spermatozoa activation rate of E.malabaricus

2.3 不同取材時期點帶石斑精子冷凍效果比較

在海南地區(qū), 點帶石斑魚的繁殖周期是從每年的 3月份開始, 到10月結(jié)束, 通常在每月的特定日期前后親魚在培育網(wǎng)箱內(nèi)發(fā)情自發(fā)交配。一個繁殖季節(jié)不同日期采集的精子樣品, 其精子冷凍-復(fù)溫后的成活率有顯著差別。如圖2所示, 親魚排精前1 d采集的樣品, 凍后精子的成活率高達(dá) 60%以上; 親魚排精后 1周取到的精液樣品, 凍后精子的成活率為50%左右; 而每年繁殖季節(jié)末期(10月)采集的精液樣品, 凍后精子的成活率非常低, 成活率不到 10%。點帶石斑魚每月排精日前后采集到的精液樣品的質(zhì)量明顯高于其他日期采集的樣品, 而每年繁殖盛期采集的精液樣品質(zhì)量也明顯高于繁殖季節(jié)末期所采集的精液樣品。因此, 為了獲得更好凍后精子的成活率,冷凍保存的精液樣品采集應(yīng)在每年繁殖盛期進(jìn)行, 在親魚排精前后采集精子樣品可獲得質(zhì)量最好的精子。

3 討論與結(jié)論

3.1 冷凍保護(hù)液對點帶石斑魚精子冷凍保存的影響

3.1.1 不同稀釋液對點帶石斑魚精子冷凍保存的影響

圖2 取材時期對點帶石斑魚凍后精子成活率的影響Fig.2 The effects of semen collection period on spermatozoa survival rate of E.malabaricus

魚類精液等排出魚體外之后, 由于環(huán)境變化不適、營養(yǎng)物質(zhì)消耗、能量代謝產(chǎn)物積累等, 精子的存活時間大大降低而導(dǎo)致快速死亡。因此需通過配置一種適宜稀釋液來延長精子的體外存活時間及活力,使精子在體外也能維持較良好的生理狀態(tài), 可以更好地抵抗冷凍降溫過程中的各種損傷[6]; 在冷凍過程中, 稀釋液不僅在維持精子的正常生理狀態(tài)方面有重要作用, 還能稀釋冷凍抗凍液的濃度, 降低抗凍液對精子毒害強(qiáng)度。適宜的稀釋液對精子沒有任何毒害作用, 因此, 配置任何稀釋液都須具備以下條件: 溶液的等滲性、各成分互不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)、能為待凍材料提供適應(yīng)的環(huán)境、適宜的pH、不能含有對待凍材料有害的物質(zhì)及含有抗菌物質(zhì)[6]。

本實驗選用了 6種不同的生理鹽溶液作為冷凍稀釋液, 均符合稀釋液的配置條件。其中TS-2在大菱鲆(Scophthalmus maximus)精子冷凍保存研究中,獲得了76.7%的凍精成活率[6]。TS-19在大菱鲆精子短期冷凍保存研究中, 獲得 80%以上的凍精成活率[12],MPRS在花鱸精子冷凍保存研究中, 獲得了最佳保存效果, 其凍精成活率達(dá) 60%±13.22%[6]。Hank’s在大黃魚精液冷凍保存研究中, 獲得了 89.7%±7.5%的凍精成活率[9]。Cortland在真鯛(Pagrosomus major)精子冷凍保存研究中, 與15% DMSO配置成冷凍保護(hù)液, 獲得81.9%±6.6%的凍精成活率[13]。0.75% NaCl溶液在黑鯛(Sparus macrocephalus )精子冷凍保存研究中, 獲得了50%以上的凍精成活率[8]。通過本實驗數(shù)據(jù)分析, 6種稀釋液中, Hank’s的保護(hù)效果最佳, 與10%～15% DMSO、15%～25%的Gly配置成的冷凍保護(hù)液, 并獲得了 60%以上的凍精成活率; 其次是TS-2和 TS-19。Hank’s應(yīng)是點帶石斑魚精子冷凍保存的最適冷凍稀釋液。

3.1.2 不同抗凍液及濃度對點帶石斑魚精子冷凍保存的影響

低溫冷凍既可以長期保存生物細(xì)胞, 也可以產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p傷并殺死生物細(xì)胞。低溫冷凍過程中, 環(huán)境的劇烈變化對生物產(chǎn)生過冷休克、冰晶損傷[14-15]、高滲休克[14,16～18]和抗凍液毒性等方面的損傷; 一般來說, 多數(shù)冷凍損傷主要發(fā)生在0～–60℃[6]。因此利用低溫冷凍保存技術(shù)進(jìn)行有效地保存生物細(xì)胞, 就必須根據(jù)生物材料的性質(zhì), 選擇相應(yīng)的冷凍保存方法來降低冷凍對生物材料的損傷程度。

本實驗中所選用DMSO、Gly和MeOH作為冷凍抗凍液, 10%～15%的DMSO及15%～25%的Gly都獲得了很好的抗凍保護(hù)效果, 其凍精成活率達(dá)到60%以上, 而10%～25% MeOH的保護(hù)效果很差, 凍精的成活率為0%。任何一種抗凍液, 對不同種魚的精液保護(hù)作用差異很大。DMSO、Gly和MeOH都是魚類精液超低溫冷凍保存常用的抗凍液; 5%～20%DMSO在多種海水魚類精液超低溫冷凍保存中都獲得了很好的效果, 如細(xì)須石首魚(Micropogon undulatus )[19]、黃鰭鯛(Sparus latus)[20]、大菱鲆[11]等。本文所得到的結(jié)果與上述5%～20% DMSO研究的結(jié)果相似。Gly 在暗紋東方 鲀(Fugu obscurus)[6]、牙鲆(Paralichthys olivaceus)[21]和大黃魚[9]的精液冷凍保存研究中, 都獲得了很好的冷凍保護(hù)效果, 凍精成活率與正常精子活力相近, 但是在圓斑星鰈(Verasper variegatus)的精液冷凍保存研究中, 卻未能起到較好的冷凍保護(hù)作用[6]。本實驗也使用10%～25%Gly做為抗凍液, 也都獲得了很好的冷凍保護(hù)效果。MeOH在淡水魚類精子冷凍保存研究中, 獲得了比較理想的保護(hù)效果, 如黃顙魚(Pelteobaggrus fulvidraco)[6], 西伯利亞鱘魚(Acipenser baeri)[22]等, 未見MeOH在海水魚類精液冷凍保存研究中, 獲得很好的抗凍保護(hù)效果文獻(xiàn)報道。而在大黃魚精液冷凍保存研究結(jié)果表明, 10%～30% MeOH保存的凍精的運動率較差。本實驗選用10%～25% MeOH做為抗凍液,均未獲得凍精的復(fù)活率; 在實驗中觀察到, 精液經(jīng)超低溫冷凍-復(fù)溫、40℃水浴中融化后, 凍存管內(nèi)明顯出現(xiàn)乳白色的黏稠絮狀物, 與未加任何冷凍保護(hù)液的凍精效果相似[15]。關(guān)于乳白色的絮狀物, 作者未見到有關(guān)文獻(xiàn)報道, 有可能該絮狀物質(zhì)出現(xiàn)是由于MeOH對精子未起到抗凍保護(hù)的作用, 導(dǎo)致精子細(xì)胞中的蛋白質(zhì)因高滲作用產(chǎn)生變性凝固。

3.1.3 抗凍液對點帶石斑魚精子的激活影響

抗凍液對生物材料不但有抗凍保護(hù)作用, 而且也會產(chǎn)生一定的毒性作用。因冷凍保護(hù)液在溶液中易結(jié)合水分子, 發(fā)生水合作用, 使溶液的黏性增加,從而弱化水的結(jié)晶作用, 減少冰晶的形成, 降低冷凍對生物材料的損傷程度[23]。因此對于低溫和超低溫冷凍保存不同魚類精子時所選用的抗凍液的種類組成和濃度是不同的。然而有文獻(xiàn)報道表明, 抗凍液對魚類精子有激活作用: 如黃曉榮等[24]對日本鰻鱺(Anguilla japonica)精子活力研究表明, 4%～24%DMSO、Gly、PG(1, 2-丙二醇)和 EG(乙二醇)都能激活日本鰻鱺的精子, 其中 8%的甘油不僅能激活精子,而且能延長日本鰻鱺精子在體外的存活時間, 存活時間長達(dá)154.6 s。

在本實驗中也同樣觀察到抗凍液可激活點帶石斑魚精子, 實驗選用10%～25% DMSO、Gly和MeOH作為抗凍液, 其中 Gly明顯可以激活點帶石斑魚精子快速運動, 10%～20% Gly的激活效果相似于天然海水激活后的效果; 但加入天然海水后, 其激活效果就急劇下降。一般來說, 各種魚類精子運動的誘導(dǎo)機(jī)制不同, 淡水魚類精子是由淡水環(huán)境的低滲誘發(fā)的, 海水魚類精子則是由海水高滲透所誘發(fā)的[23]。與本實驗觀察結(jié)果來看, 不同濃度的 Gly對精子的激活效果, 在加海水前后的變化差異明顯, 這種現(xiàn)象也許是甘油在加入海水后導(dǎo)致混合溶液的滲透性大大降低, 導(dǎo)致精子無法獲取能運動停止而產(chǎn)生的。

3.2 取材時期對點帶石斑魚精子冷凍保存的影響

在魚類人工繁育中, 卵子質(zhì)量一直以來都是研究者最關(guān)注的核心問題。然而魚類受精卵的質(zhì)量好壞, 不單是與卵子質(zhì)量的好壞有直接聯(lián)系, 精子的質(zhì)量同樣也直接影響受精卵的質(zhì)量[25]。在魚類精液低溫冷凍保存研究中, 精液的質(zhì)量尤其重要, 一旦獲得的精液質(zhì)量不理想, 就意味著后期冷凍保存也不理想。繁殖季節(jié)內(nèi), 親魚個體大小、養(yǎng)殖溫度和模式、季節(jié)、營養(yǎng)狀況、采精頻率及催產(chǎn)素使用情況都會影響魚類精子的質(zhì)量[25]。本實驗在點帶石斑魚繁殖季節(jié)的3個不同時期采取精液, 即排精前1 d、排精后 1周和繁殖季節(jié)末期; 通過冷凍保存實驗的結(jié)果得知, 排精前1 d的精液質(zhì)量最佳, 排精前1 d和排精后 1周取得精液質(zhì)量明顯優(yōu)于繁殖季節(jié)末期的。這種現(xiàn)象與親魚的營養(yǎng)狀況、排精次數(shù)、催產(chǎn)素使用情況及外界環(huán)境因素有關(guān)。因此, 為了能獲取到更好的冷凍保存點帶石斑魚的精液材料, 最佳精液采集時期應(yīng)在點帶石斑魚的親魚產(chǎn)卵前 1 d進(jìn)行采集。

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