劉 波, 陳宇鋒, 鄭惠東, 許貽斌, 鄭盛華, 鐘碩良

(福建省水產(chǎn)研究所, 福建 廈門 361013)

彗星實(shí)驗(yàn)又稱單細(xì)胞凝膠電泳(Single Cell Eletrophoresis, SCGE), 最早由Ostling等[1]于1984年提出, 根據(jù)電泳后DNA的拖尾長度定量檢測真核細(xì)胞中的 DNA損傷程度。后經(jīng)其他學(xué)者不斷改進(jìn), 使SCGE敏感性大大提高, 不僅可以檢測到DNA雙鏈和單鏈斷裂, 還能檢測到DNA的堿性不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[2-4]。目前, SCGE主要應(yīng)用于哺乳動(dòng)物淋巴細(xì)胞DNA損傷等研究領(lǐng)域[5-7], 在水生生物細(xì)胞損傷的研究方面報(bào)道較少, 現(xiàn)有研究可見 SCGE檢測真鯛(Pagrosomus major)血細(xì)胞 DNA損傷及扇貝血淋巴細(xì)胞DNA損傷等報(bào)道[8-9]。醚菊酯作為常用的醚類農(nóng)藥,兼具了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的優(yōu)點(diǎn), 是20世紀(jì)70年代迅速發(fā)展起來的新型農(nóng)藥, 具有高效、低毒、低殘留等環(huán)境安全性的優(yōu)點(diǎn)[10]。近年來, 由于菊酯類農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用和人類活動(dòng)的不斷增加, 其代謝產(chǎn)物在食品和水環(huán)境中的影響日益嚴(yán)重。醚菊酯在環(huán)境和生物樣品中的殘留及分布表現(xiàn)為明顯的接觸性特點(diǎn),這與擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的殘留特點(diǎn)相似, 其對(duì)養(yǎng)殖生物遺傳物質(zhì)的基因毒性進(jìn)一步引起人們的擔(dān)憂。但是, 有關(guān)醚菊酯等菊酯類農(nóng)藥的相關(guān)研究主要集中在神經(jīng)毒性和環(huán)境內(nèi)分泌干擾方面[11-12], 國內(nèi)外關(guān)于醚菊酯基因毒性的研究報(bào)道較少。

日本囊對(duì)蝦是中國沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖重要經(jīng)濟(jì)種類之一, 在海水養(yǎng)殖生物中具有良好的代表性,醚菊酯是否對(duì)日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus japonicas)肝胰腺細(xì)胞具有遺傳毒性作用而引起DNA損傷, 國內(nèi)外尚未見報(bào)道。作者通過彗星實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究醚菊酯對(duì)日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞DNA的損傷特征, 探討了醚菊酯對(duì)日本囊對(duì)蝦的遺傳毒性機(jī)制, 為中國沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的污染監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

醚菊酯為廣州植物龍生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠、綠色熒光DNA染料、EDTA溶液(0.5 mol/L)、10×細(xì)胞裂解液(0.1 mol/L Tris, 10%肌氨酸鈉, 10% Triton X-100)為美國CELL BIOLABS公司產(chǎn)品; NaCl、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4等常規(guī)藥品均為國產(chǎn)分析純?cè)噭? 上海生物工程有限公司產(chǎn)品。

實(shí)驗(yàn)用玻片為美國Cell Biolabs公司產(chǎn)品, 超凈工作臺(tái)為蘇州智凈化設(shè)備有限公司的 SW-CJ-1D型,電熱恒溫水浴鍋為上海精宏公司的DK-S26型, 電泳儀為美國 Thermo公司的EC250-90型, 水平電泳槽為北京君意公司的 JY-SP-E型, 熒光顯微鏡為德國Leica公司的DM5500 B型。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用日本囊對(duì)蝦購自福建省水產(chǎn)研究所大徑中試基地附近的農(nóng)貿(mào)市場, 平均體長(11.36±0.93)cm,平均體質(zhì)量(10.72±2.70)g。在水泥池中暫養(yǎng)一周, 每天定時(shí)定量投喂對(duì)蝦配合飼料, 挑選健康無病、附肢齊全無外傷且規(guī)格統(tǒng)一的對(duì)蝦作為實(shí)驗(yàn)用蝦。

1.3 處理方法

急性毒性實(shí)驗(yàn)表明, 日本囊對(duì)蝦的死亡率與醚菊酯的濃度顯著性正相關(guān)(P<0.01), 具有明顯的濃度-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系, 醚菊酯對(duì)日本囊對(duì)蝦24、48和 96 h 半致死濃度(LC50)分別為 1.88×10–3、1.30×10–3和 0.76×10–3mg/L。根據(jù) LC50值和特倫堡(Tumbel)安全濃度計(jì)算公式(SC=48 h LC50×0.3/(24h LC50÷48h LC50)2), 綜合考慮近海海水中醚菊酯低濃度水平因素, 設(shè)定亞急性毒性實(shí)驗(yàn)的處理濃度, 將日本囊對(duì)蝦分為6組進(jìn)行不同劑量的處理, 設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照組, 5 個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組(1.5×10–5, 0.3×10–4, 0.9×10–4,1.8×10–4, 3.6×10–4mg/L), 每組 30 尾日本囊對(duì)蝦。在1 m2的水泥池內(nèi)用沙濾海水微充氣正常培育, 實(shí)驗(yàn)過程中海水溶解氧(5.62±0.18)mg/L、pH(8.06±0.08)、水溫(18.36±0.26)℃、鹽度(30.00±0.02)。每日更換實(shí)驗(yàn)用水, 重新設(shè)置醚菊酯的相應(yīng)處理濃度, 保證實(shí)驗(yàn)期間處理濃度一致。各實(shí)驗(yàn)處理組在持續(xù)處理25 d后隨機(jī)采集3尾日本囊對(duì)蝦, 放入冰盒備用。

1.4 細(xì)胞懸液制備

剪取各實(shí)驗(yàn)處理組日本囊對(duì)蝦肝胰腺組織0.2～0.5 g至1.5 mL滅菌離心管內(nèi), 各實(shí)驗(yàn)處理組設(shè)置為3組平行, 加入4℃預(yù)冷的0.01 mol/L PBS緩沖液(含0.02 mol/L EDTA)1 mL, 冰浴搗碎組織懸浮細(xì)胞, 懸浮液靜置5 min后轉(zhuǎn)入新的離心管, 3000 r/min離心2 min后棄上清, 用4℃預(yù)冷的0.01 mol/L PBS緩沖液重懸細(xì)胞, 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為 1×105個(gè)/mL, 鏡檢觀察細(xì)胞活性后待用。

1.5 彗星實(shí)驗(yàn)方法

按照Cell Biolabs公司的彗星分析試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳分析[13]。

1.5.1 制片

將彗星分析試劑盒的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠在90～95℃水浴鍋內(nèi)加熱溶解20 min, 再轉(zhuǎn)入37℃水浴鍋冷卻20 min備用。細(xì)胞懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠按1∶10的比例混合, 迅速吸取75μL混合液均勻涂抹于彗星分析玻片上, 將玻片置于4℃冰箱避光固化15 min。

1.5.2 裂解和解旋

將玻片放入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(2.5 mol/L NaCl,0.1 mol/L EDTA, 0.01 mol/L Tris, 1%肌氨酸鈉, 1%Triton X-100, pH10.0)中, 置于4℃冰箱避光裂解30～60 min。裂解完畢后用蒸餾水小心的沖洗玻片, 將清洗后的玻片放入預(yù)冷的堿性液(0.3 mol/L NaOH, 1 m mol/L EDTA, pH>13)中, 置于4℃冰箱避光解旋30 min。

1.5.3 電泳和染色

將玻片小心地移入水平電泳槽, 倒入預(yù)冷的堿性電泳緩沖液(0.3 mol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA,pH>13), 在電壓1 V/cm, 電流300 mA的條件下電泳15～30 min。電泳結(jié)束后輕輕移出玻片, 用預(yù)冷的蒸餾水浸泡2 min, 重復(fù)兩次洗去多余堿, 再用70%酒精浸泡固化5 min。將玻片取出完全空干, 每個(gè)處理滴加100 μL的綠色熒光DNA染料, 室溫避光染色15 min。

1.6 圖像分析和數(shù)據(jù)處理

通過熒光顯微鏡觀察玻片, 并進(jìn)行顯微攝影,每個(gè)處理采集60個(gè)細(xì)胞進(jìn)行拍照和數(shù)據(jù)分析, 各實(shí)驗(yàn)處理組3個(gè)平行共統(tǒng)計(jì)180個(gè)細(xì)胞。圖像用彗星分析軟件Comet Score 1.5進(jìn)行分析, 采用拖尾率、彗星尾長、彗尾DNA相對(duì)含量、尾距和Olive距等參數(shù)評(píng)價(jià)日本囊對(duì)蝦DNA的損傷程度。其中拖尾率=拖尾細(xì)胞數(shù)/觀察細(xì)胞數(shù)×100%、彗尾DNA相對(duì)含量=尾部 DNA含量/細(xì)胞總 DNA含量×100%、尾距=尾長×彗尾 DNA相對(duì)含量×100%、Olive距=頭尾部中心間距×彗尾DNA相對(duì)含量×100%。應(yīng)用Excel軟件及SPSS16.0軟件對(duì)所獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析, 檢驗(yàn)顯著性并計(jì)算出回歸方程。

2 結(jié)果

2.1 醚菊酯處理對(duì)日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞DNA的影響

醚菊酯對(duì)日本囊對(duì)蝦 24h和 48h半致死濃度(LC50)分別為 1.88×10–3mg/L 和 1.30×10–3mg/L, 根據(jù) LC50值和特倫堡(Tumbel)安全濃度計(jì)算公式(SC=48 h LC50×0.3/(24h LC50÷48h LC50)2)計(jì)算得出其安全濃度為0.19×10–3mg/L。在此基礎(chǔ)上對(duì)各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行處理, 各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)熒光染料染色后在熒光顯微鏡下觀察, 隨機(jī)采集180個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 空白對(duì)照組的肝胰腺細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)緊密, 染色后呈圓形熒光團(tuán), 無拖尾現(xiàn)象; 各實(shí)驗(yàn)處理組損傷細(xì)胞DNA的斷裂碎片在電場中離開核DNA向陽極遷移,染色后形成彗星狀拖尾。隨著處理濃度的增加, 細(xì)胞核DNA損傷越嚴(yán)重, 斷裂的碎片或堿變性片段就越多, 彗星尾長相應(yīng)增加, 尾部熒光強(qiáng)度也相應(yīng)增強(qiáng)。圖 1為醚菊酯不同處理濃度對(duì)日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞DNA損傷的單細(xì)胞凝膠電泳彗星圖像。表1是醚菊酯不同處理濃度對(duì)日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞DNA損傷的彗星實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果, 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 不同實(shí)驗(yàn)處理組的拖尾率、彗星尾長、彗尾DNA相對(duì)含量、尾距和Olive距與空白對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 差異極顯著。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示對(duì)照組受損細(xì)胞極少, 拖尾率僅為5.06%±0.87%, 彗尾DNA相對(duì)含量、尾距和Olive距都接近0, 細(xì)胞沒有發(fā)生 DNA 斷裂形成彗星圖像; 1.5×10–5～3.6×10–4mg/L醚菊酯處理25 d后各指標(biāo)值相應(yīng)增加, 且當(dāng)處理劑量為 3.6×10–4mg/L時(shí), 各指標(biāo)值迅速顯著增加, 說明日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞對(duì)醚菊酯毒性存在較為敏感的閾值范圍。

圖1 醚菊酯不同處理濃度對(duì)日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞DNA損傷的彗星圖像Fig.1 The comet assay images of DNA damage in hepatopancreas cells of Marsupenaeus japonicas exposed to different concentrations of ethofenprox

表1 醚菊酯不同處理濃度對(duì)日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞DNA損傷的彗星實(shí)驗(yàn)指標(biāo)數(shù)據(jù)Tab.1 The parameters of DNA damage in hepatopancreas cells of Marsupenaeus japonicas exposed to different concentrations of ethofenprox using comet assay method

2.2 日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞 DNA損傷各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與醚菊酯處理濃度的回歸分析

表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)數(shù)據(jù)隨著處理濃度的變化顯著增加, 呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系,各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與處理濃度之間存在較好的相關(guān)性。經(jīng)彗星分析軟件Comet Score 1.5 得到的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與醚菊酯處理濃度進(jìn)行線性、多項(xiàng)式和指數(shù)擬合回歸分析后, 其多項(xiàng)式回歸分析擬合度(R2>0.99)最高,各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的回歸方程如表 2所示。醚菊酯處理濃度與彗星尾長、Olive距、彗尾DNA相對(duì)含量和拖尾率等參數(shù)的多元回歸方程為Y=–0.256 + 0.122X1+0.11X2– 0.0255X3– 0.044X4(P<0.005), 其中Y表示醚菊酯處理濃度,X1表示彗星尾長,X2表示Olive距,X3表示彗尾DNA相對(duì)含量,X4表示拖尾率, 回歸方程相關(guān)極顯著。

表2 醚菊酯不同處理濃度對(duì)日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞DNA損傷各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的回歸方程Tab.2 The regression equation of parameters of DNA damage in hepatopancreas cells of Marsupenaeus japonicas exposed to different concentrations of ethofenprox

3 討論與結(jié)論

醚菊酯作為一種廣泛使用的菊酯類農(nóng)藥, 通過作用神經(jīng)軸突, 抑制相應(yīng)神經(jīng)功能發(fā)揮滅殺作用[14],菊酯類農(nóng)藥在遺傳物質(zhì)基因毒性的作用機(jī)制方面研究還不多, 有研究報(bào)道表明, 菊酯類農(nóng)藥在各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可導(dǎo)致血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、肝腸等組織細(xì)胞遺傳毒性作用, 產(chǎn)生DNA雙鏈、單鏈斷裂和姐妹染色單體交換等現(xiàn)象[15-17]。作者選用拖尾率、彗星尾長、彗尾DNA相對(duì)含量、尾距和Olive距等國內(nèi)外各彗星圖像分析軟件使用的標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo), 應(yīng)用Comet Score 1.5彗星圖像分析軟件對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行精確的測定分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 實(shí)驗(yàn)選擇的處理時(shí)間和濃度在彗星實(shí)驗(yàn)檢測閾值范圍內(nèi)[18], 隨著處理濃度的增加, 肝胰腺細(xì)胞 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)越松散, 斷裂點(diǎn)越多, DNA碎片越小, 向陽極遷移的彗星尾部DNA片段越多, 檢測指標(biāo)都呈漸進(jìn)的規(guī)律性趨勢,表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系, 說明上述檢測指標(biāo)在本實(shí)驗(yàn)條件下能較客觀地反映DNA損傷程度, 具有良好的代表性。這與Hellman等[19]的報(bào)道一致: 在一定的閾值范圍內(nèi), 彗星尾長、彗尾DNA相對(duì)含量、尾距和Olive距等指標(biāo)的分析結(jié)果比較可信。各檢測指標(biāo)數(shù)據(jù)表明, 醚菊酯對(duì)日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞DNA作用較為敏感, 處理濃度在較低水平1.5×10–5mg/L時(shí), 實(shí)驗(yàn)處理組與空白對(duì)照組相比各檢測指標(biāo)就表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.01), 而當(dāng)處理濃度達(dá)到 3.6×10–4mg/L, 超過安全濃度 1.9×10–4mg/L(根據(jù)特倫堡Tumbel安全濃度公式計(jì)算得出)時(shí), DNA損傷顯著加劇, 該實(shí)驗(yàn)處理組與其他各實(shí)驗(yàn)處理組相比各檢測指標(biāo)都表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.01), 說明日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞對(duì)醚菊酯毒性存在高速反應(yīng)的閾值范圍。

由于人類農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)的廣泛開展, 其長期持續(xù)用藥導(dǎo)致近海海域生態(tài)環(huán)境低濃度長時(shí)間污染,造成養(yǎng)殖生物魚、蝦、貝的長期暴露, 因此, 為了全面評(píng)價(jià)醚菊酯在近海海域生態(tài)環(huán)境中的影響因子,作者對(duì)實(shí)驗(yàn)各檢測指標(biāo)進(jìn)行回歸分析和相關(guān)分析,數(shù)據(jù)分析表明各檢測指標(biāo)與處理濃度之間存在高度的相關(guān)性, 且各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05), 幾何參數(shù)彗星尾長是較為直接的可靠指標(biāo), 而尾距和Olive距則更能全面地反映處理濃度對(duì)肝胰腺組織細(xì)胞DNA的損傷程度。在處理濃度與彗星尾長、尾距、Olive距、彗尾DNA相對(duì)含量和拖尾率等參數(shù)的多元回歸分析過程中發(fā)現(xiàn), 處理濃度對(duì)尾距和Olive距的影響作用類似, 但Olive距的回歸方程顯著性更高(P<0.005), 尾距表現(xiàn)為排除的變量。多元回歸方程表明, 對(duì)于日本囊對(duì)蝦肝胰腺組織而言, 最好的檢測參數(shù)是彗星尾長和Olive距, 即產(chǎn)生影響最顯著的因素。本實(shí)驗(yàn)在對(duì)各指標(biāo)分別建立一元回歸方程的基礎(chǔ)上, 又通過 SPSS軟件進(jìn)行聚類和判定分析, 篩選影響因子更大的檢測指標(biāo), 建立了多參數(shù)的多元回歸方程進(jìn)行全面的DNA損傷變化規(guī)律研究, 并擬通過多元回歸方程有效地推斷醚菊酯處理濃度和處理時(shí)間, 為評(píng)估菊酯類農(nóng)藥等污染物對(duì)近海海域生態(tài)環(huán)境的影響奠定基礎(chǔ)。

DNA損傷可以導(dǎo)致各種類型的突變, 包括潛在長期的致癌效應(yīng)和致畸效應(yīng)等[20], 作者以日本囊對(duì)蝦肝胰腺細(xì)胞為研究對(duì)象, 采用標(biāo)準(zhǔn)的彗星實(shí)驗(yàn)分析方法對(duì)醚菊酯的遺傳毒性進(jìn)行檢測, 證明醚菊酯對(duì)沿海地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的致突變、致癌、致畸等危害作用應(yīng)該引起人們的足夠重視, 這種潛在長期的危害會(huì)嚴(yán)重影響近海海域水生生物種質(zhì)資源, 造成種質(zhì)衰退、種群數(shù)量減少等問題。我們認(rèn)為, 菊酯類農(nóng)藥造成DNA損傷的主要途徑是通過自由基活化,與DNA的無嘌呤位點(diǎn)結(jié)合形成堿性不穩(wěn)定位點(diǎn), 最終DNA鏈在堿性條件下發(fā)生斷裂, 這與其他文獻(xiàn)的觀點(diǎn)一致[21]。研究發(fā)現(xiàn), 單細(xì)胞凝膠電泳彗星實(shí)驗(yàn)可以在細(xì)胞分子水平直接反映出生態(tài)環(huán)境污染對(duì)水生生物的影響, 通過對(duì) DNA損傷的評(píng)估, 這一技術(shù)手段有望成為監(jiān)測近海菊酯類農(nóng)藥等污染物對(duì)水生生物基因毒性的新方法, 在該研究領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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