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        抗體在靶向基因治療中的應用

        2014-11-30 09:08:18王維剛
        中國醫(yī)藥生物技術 2014年4期
        關鍵詞:基因治療脂質體復合物

        王維剛

        基因治療是將人的正?;蚧蛴屑膊≈委熥饔玫幕驅肴梭w靶細胞,從而達到治療目的的生物醫(yī)學技術?;蛑委熣幱诔掷m(xù)發(fā)展的階段,已成為重要的醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)。綜合來說,抗體在基因治療中主要應用于兩方面:①直接將抗體基因導入體內,表達出的蛋白產(chǎn)物作為治療分子發(fā)揮治療作用[1-2];②作為基因轉移系統(tǒng)的靶向成分在基因治療中發(fā)揮作用。本文將重點介紹第二方面的研究進展。

        將編碼治療分子的 DNA,siRNA(small interfering RNA)或反義 RNA(antisense oliognucleotides)高效、準確地轉入體內靶組織和靶細胞是將基因治療應用于臨床的最大技術障礙?;蜣D運方式主要有兩種:病毒法[3]和非病毒法??贵w作為靶向成分在這兩類方法中都起著重要作用。利用逆轉錄病毒、腺病毒進行基因轉移的方法缺乏組織、細胞特異性。病毒載體的宿主組織/細胞嗜向性是由病毒衣殼上的蛋白分子(包膜蛋白)決定的。利用基因工程抗體技術將包膜蛋白進行一些修飾,例如與 scFv 做成嵌合蛋白即可賦予病毒新的結合特性。納米載體(包括脂質體、陽離子多聚體復合物兩種形式)的應用在一定程度上改善了 DNA或 siRNA 的體內轉運,但并沒有在實質上解決組織特異性轉運的問題。因此,一種“靶向納米載體”的概念應運而生。這一概念涉及到兩類方法。第一類方法主要依靠“細胞導向配基”(cell targeting ligands,CTLs),比如可以特異性結合脂蛋白受體、整合素、酪氨酸激酶受體以及 G 蛋白偶聯(lián)受體——GPCR 的短肽和“細胞穿透肽”(cell penetrating peptides,CPPs),比如以 Tat、antennepedia 為代表的短肽[4]。在第二類方法中,抗體作為轉運載體的一部分,可以將編碼毒素、治療分子的基因或 siRNA 選擇性地攜帶到靶組織,并將其導入靶細胞。發(fā)展以抗體為基礎的基因轉移,其關鍵在于抗體-DNA/siRNA 復合物需要同時滿足兩個條件:第一,所用單抗須具有進行細胞導向所必需的抗原結合特異性;第二,復合物不僅要易于被靶細胞內吞,而且被攜帶的 DNA/siRNA 需要從內涵體中釋放至細胞質中,對DNA 而言還要進入細胞核內,從而實現(xiàn)有效的基因轉錄和翻譯。

        1 抗體作為載體攜帶 siRNA

        圖1 抗體介導 siRNA導向轉運的兩種策略(A:單鏈抗體-魚精蛋白-siRNA 復合物;B:單鏈抗體靶向的納米脂質體-siRNA 復合物)

        近年來,siRNA 作為藥物的開發(fā)進展迅速,比如針對年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)的 siRNA 治療進入了臨床 III 期。特異、高效地將siRNA 導入靶細胞是臨床治療所面臨的最大挑戰(zhàn)。近年來的一系列研究表明抗體介導的 siRNA 導向治療是可行的。研究者大致采用兩種策略(圖 1)。第一種方法綜合了抗體的特異性和魚精蛋白(protamine,一種小分子堿性蛋白)的核酸結合屬性。將兩者制成融合蛋白,再與 siRNA 混合形成復合物,從而實現(xiàn)特異性的 siRNA 導向。第二種方法又稱納米免疫脂質體法,主要涉及兩步驟:首先用抗體對脂質體表面進行偶聯(lián)修飾制成免疫脂質體,從而賦予其導向性;然后將 siRNA 包裹在上述免疫脂質體中。以下將分別討論這兩種策略在 siRNA 導向治療中的應用。

        2005年,Song 等[5]在 Nature Biotechnology 首次報道了一項抗體介導的 siRNA 體內導向研究。用 Fab 或 scFv抗體片段與魚精蛋白制成融合蛋白,再與 siRNA 混合形成復合物。該納米復合物的大小剛好高于腎清除的臨界值(30~50 kD),改進了裸 siRNA 半衰期短的缺陷。采用表達 HIV 包膜蛋白的黑色素瘤體內模型,將上述復合物與針對腫瘤相關基因的 siRNA(c-myc、MDM2、VEGF)混合并給予荷瘤小鼠,可以將 siRNA 特異性地導入到表達抗體相應抗原的細胞中,有效抑制腫瘤生長。作者還制成了另一融合蛋白:抗 ErbB2 scFv-魚精蛋白。該融合蛋白可將siRNA 特異性地導入 ErbB2 陽性的乳腺癌腫瘤。Peer 等[6]采用了類似的方法將抗淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)scFv 與魚精蛋白制成融合蛋白,可以高效、特異地將 siRNA導入原代淋巴細胞、單核細胞和樹狀細胞。體外、體內試驗證明該轉運系統(tǒng)可以特異地抑制目標基因的表達。

        基于類似的思路,一些研究者用抗體進行針對病毒基因的 siRNA 體內導向。Wen 等[7]用抗 HBV scFv或 scFv-Fc片段與魚精蛋白融合,該融合蛋白可將 siRNA 或 siRNA表達質粒導入轉基因鼠體內的靶細胞并抑制基因表達。Kumar 等[8]則嘗試用抗 CD7 scFv 與一段含 9 個精氨酸的短肽偶聯(lián),該偶聯(lián)物可將抗病毒 siRNAs 特異地導向小鼠體內的幼稚 T 細胞,從而抑制 HIV 感染。

        免疫脂質體(immunoliposome)又名抗體-脂質體偶聯(lián)物,由抗體和脂質體連接而成,是癌癥化療中重要的藥物靶向載體系統(tǒng),近幾年來已經(jīng)開始用于靶向基因治療。早期用于核酸轉移的免疫脂質體多采用完整抗體,并著重于方法學研究。之后以 scFv 片段作為導向載體的研究取得顯著進展。2006年以來,Pirollo 研究組[9-10]發(fā)表了一系列采用納米免疫脂質體進行體內 siRNA 靶向治療的研究報道,用抗轉鐵蛋白 scFv 制成納米免疫脂質體進行體內抗 HER2 siRNA 導向,可以顯著降低腫瘤細胞 HER2 基因表達,增強腫瘤對化療的敏感性。為了提高 siRNA 導向效率,對納米免疫脂質體做了一系列改進。首先,在該復合物中加入了一種對酸堿度敏感的組氨酸/賴氨酸短肽,提高了細胞內化后 siRNA 從內涵體的釋放率。其次,采用了比傳統(tǒng)的siRNA 更穩(wěn)定、更高效的 DNA-RNA 雜合雙鏈。Peer 等[11]采用類似思路,將抗 Cyclin D1 siRNA 系統(tǒng)地導入體內特定白細胞亞群,其靶向轉運是通過抗 β7 整合蛋白完整單抗來實現(xiàn)的。Zhang 等[12]則采用了一種略微不同的策略將siRNA 質粒導入小鼠腦組織治療腦癌。他們選擇 EGFR 作為 siRNA 靶點,并用兩種單抗對聚乙二醇化的脂質體表面進行修飾:抗鼠轉鐵蛋白單抗使免疫脂質體得以穿過血腦屏障;抗人胰島素受體單抗可以使免疫脂質體-siRNA 復合物特異地結合腦瘤細胞表面受體并引發(fā)內化。結果表明靜脈注射該免疫脂質體-siRNA 復合物可明顯降低腦瘤 EGFR 表達水平,顯著延長荷瘤小鼠存活時間(88%)。

        Avidin-Biotin 是一項穩(wěn)定、可靠的蛋白連接技術,近年也有多篇報道嘗試將其用于 siRNA 的抗體導向治療[13-14]。將 siRNA 3' 末端生物素化,再與單抗-親和素(抗生物素蛋白)偶聯(lián)物混合,即可制成穩(wěn)定的單抗-siRNA 復合物。靜脈注射該抗轉鐵蛋白單抗-siRNA 復合物可以有效降低小鼠腦內細胞中靶基因的表達(抑制率 69%~81%)。

        2 抗體作為載體攜帶毒素或其他治療基因

        抗體用于基因治療靶向載體的嘗試,實際上最早是由攜帶編碼治療分子的基因開始的。基因治療藥物的給藥途徑有兩種:即 in vivo 及 ex vivo 方式。

        2.1 In vivo 途徑

        這種途徑是指將外源基因裝配于真核細胞表達載體中,直接導入體內??贵w作為載體攜帶毒素基因或其他治療基因大體也是基于以下兩種方法。第一,利用抗體與某些正電荷短肽的融合/偶聯(lián)蛋白;第二,納米免疫脂質體法。

        除了魚精蛋白以外,研究者也嘗試利用其他正電荷短肽結合抗體進行基因導向,應用較多的是聚乙烯亞胺(PEI)。用化學方法將單抗或單抗片段與 PEI 偶聯(lián),再與 DNA 混合即可制成納米顆粒。一系列抗體,包括抗 G250、Hsp70、HER2、CD3、CD90、EGFR 的單抗或 scFv 與 PEI 偶聯(lián)物可以將 DNA 表達載體高效、特異地導入到表達相應抗原的靶細胞中[15-20]。

        大多數(shù)免疫脂質體導向基因轉運研究均停留于體外方法學研究階段。值得注意的是,Chang 研究組在小鼠體內進行了一系列納米免疫脂質體導向基因治療研究。用抗轉鐵蛋白 scFv 制成納米免疫脂質體攜帶 p53 表達載體[21],該納米免疫脂質體-p53 復合物可以將 p53 基因有效地轉入靶細胞并表達。聯(lián)合給予該復合物和化療藥可以顯著延長荷瘤鼠存活時間。Pirollo 等[22]用上述免疫脂質體進行體內RB94 導向基因轉運,結果表明該免疫脂質體可以將 RB94基因定向轉入腫瘤細胞和組織,顯著增強腫瘤對化療藥的敏感性。

        除上述兩種主流方法外,利用 Biotin-Avidin 技術[23]或化學法[24]直接連接抗體和 DNA 載體進行導向基因轉移的研究亦有報道。

        2.2 Ex vivo 途徑

        這是指將含外源基因的載體在體外導入自身或異體細胞(或異種細胞),經(jīng)體外擴增后,再將細胞輸回人體。Ex vivo 基因轉移途徑比較經(jīng)典、安全,但是步驟多、技術相對復雜。

        Chen 等[25]在 1997年首次報道了轉染后的哺乳動物細胞可以長期產(chǎn)生和分泌免疫毒素。他們建立了一種特異性針對腫瘤或 HIV-1 感染細胞的新型殺傷細胞,該細胞顯著抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長,延長動物存活期。之后,Yang研究組陸續(xù)進行了一系列抗體導向的免疫促凋亡蛋白(immunoproapoptotic proteins)對腫瘤的殺傷作用研究[26]。他們選擇在乳腺癌、卵巢癌及胃癌中呈現(xiàn)過度表達的 HER2作為靶標??寺「脑烊舜俚蛲龇肿?caspas-3、caspas-6、Granzyme B、AIF 和 BID 等基因,將其與銅綠假單胞菌外毒素 A(PEA)轉膜結構域基因和抗 HER2 抗體的基因重組,構建成靶向促凋亡分子基因(圖 2)。理論上,用該重組表達載體轉染細胞后,抗體-促凋亡蛋白表達后被分泌出細胞外,選擇性地與 HER2 陽性的靶腫瘤細胞結合并內化,促凋亡蛋白繼而在內涵體中被前蛋白轉換酶 Furin 或其他蛋白酶剪切后釋放到靶細胞的細胞質,最終誘導腫瘤細胞凋亡。研究者用重組表達載體轉染人淋巴瘤 Jurkat 細胞并建成能穩(wěn)定表達、分泌抗體-促凋亡蛋白的細胞系,再將該細胞培養(yǎng)擴增,并靜脈注射荷瘤裸鼠。結果表明,該細胞產(chǎn)生的促凋亡蛋白特異性地分布在腫瘤組織,對 HER2 陽性的乳腺癌、胃癌、肝癌、骨肉瘤、卵巢癌細胞具有高效的殺傷作用。荷瘤裸鼠腫瘤生長受到抑制,存活期顯著延長。進而對免疫促凋亡分子中的 PEA 轉膜結構域部分進行改造并引入了前蛋白轉換酶 Furin 蛋白酶切割位點序列,結果證實這種轉膜結構域替換后的靶向促凋亡分子仍能從內吞體轉位到細胞質,并有效地殺傷腫瘤細胞。

        圖2 抗體導向的免疫促凋亡蛋白

        3 結語

        與早期抗體藥物的發(fā)展過程相仿,基因治療正處于一個緩慢但持續(xù)進步的階段。以抗體為基礎的基因治療為疾病的治療提供了新思路,可以作為手術、化療、放療等傳統(tǒng)治療方案的輔助措施??贵w或抗體片段可以直接作為治療分子在體內表達,發(fā)揮對疾病的治療作用,也可以間接作為基因轉移系統(tǒng)的靶向成分。盡管還有許多需要解決的技術問題,但值得強調的是,抗體為基礎的基因治療所面臨的大部分問題也是其他治療方法的共同問題。任何相關領域的重大突破也必將極大推動以抗體為基礎的基因治療的發(fā)展。

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