吳 卿，李 云，李亞男，田一梅，彭 森

（1.天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072；2.太原理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，太原 030024）

隨著國內(nèi)城市中水深度處理技術(shù)的不斷進步，再生水的應(yīng)用領(lǐng)域變得更加廣泛.將城市污水再生水作為工業(yè)冷卻補充水的水源是目前世界各國解決缺水問題的首選方案，而其帶來的微生物腐蝕問題是目前各工業(yè)企業(yè)關(guān)注的焦點.金屬腐蝕是由金屬表面、無機腐蝕產(chǎn)物、微生物細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物協(xié)同作用產(chǎn)生的.鐵細(xì)菌又稱為鐵氧化細(xì)菌（iron-oxidizing bacteria， IOB），是造成金屬腐蝕的主要微生物之一.IOB能將二價鐵氧化成三價鐵然后轉(zhuǎn)化為FeOH3沉淀，并從中獲取能量[1].這些氫氧化鐵在管壁表面形成沉淀，在管道表面形成小陽極點，與水體中氧氣存在的大范圍陰極區(qū)域形成原電池，發(fā)生局部腐蝕[2-3].在微生物腐蝕方面，現(xiàn)有研究主要集中在鐵細(xì)菌與其他細(xì)菌共同作用產(chǎn)生腐蝕方面[4-6]，而有關(guān)鐵細(xì)菌的生長特性及其引起的腐蝕機理方面的研究較少.為了研究鐵細(xì)菌的腐蝕作用，本文通過相應(yīng)的電化學(xué)實驗以及靜態(tài)掛片腐蝕實驗來研究鐵細(xì)菌對碳鋼的腐蝕行為.

1 實驗部分

1.1 材料與設(shè)備

所用材料包括：菌種，由冷卻塔下的儲水池中所取循環(huán)冷卻水中獲??；尿素培養(yǎng)基[7]、Winogradsky培養(yǎng)基[8]、Stokes培養(yǎng)基[7]、CGY培養(yǎng)基[7]、碳源利用鑒定培養(yǎng)基[7]、生長特性基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]，自制；葡萄糖、蔗糖、甘油、可溶性淀粉，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；乳糖、檸檬酸鈉、草酸鈉、半乳糖，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；NH4NO3、（NH4）2SO4，天津市天大化工實驗廠生產(chǎn)；尿素，天津市江天化工技術(shù)有限公司生產(chǎn)；KNO3、NaNO3，天津市津科精細(xì)化工研究所生產(chǎn).

所用設(shè)備包括：WKMZ-Ⅱ型智能動態(tài)模擬裝置，高郵市新郵儀器廠生產(chǎn)，設(shè)定濃縮倍數(shù)3.0，進口溫度25℃，pH控制在8.5以下，以天津市某再生水廠出水為補充水，不投加殺生劑；CS2350電化學(xué)工作站，武漢科斯特公司生產(chǎn)，Q235碳鋼工作電極內(nèi)徑為8 mm、有效截面積為0.502 4 cm2；Q235標(biāo)準(zhǔn)腐蝕掛片，高郵市新郵儀器廠生產(chǎn)，長×寬×厚為50 mm×25 mm×2 mm，本研究所采用的Q235碳鋼成分為C（≤0.22%）、Mn（≤1.4%）、Si（≤0.35%）、S（≤0.050%）、P（≤0.045%），余量為Fe；XL-30TMP型環(huán)境掃描電子顯微鏡（EMES），荷蘭Philips公司產(chǎn)品.

1.2 較為純凈的菌種培養(yǎng)

取水樣接種到尿素培養(yǎng)基、Stokes培養(yǎng)基富集得到鞘細(xì)菌，在28℃下培養(yǎng)24～48 h，觀察取出培養(yǎng)基中的半透明絮體，接種到Winogradsky培養(yǎng)基上，在28℃下進行培養(yǎng)，富集得到具有氧化鐵能力的鞘細(xì)菌[7-8].對氧化鐵鞘細(xì)菌進行分離，可在Stokes培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%~2.0%的瓊脂，制成固體培養(yǎng)基，采用劃線分離的方法分離得到單個菌落.將分離得到的菌落接種到CGY培養(yǎng)基上，等形成大量的單菌體后，用無菌水制備形成適當(dāng)濃度的菌懸濁液.得到的菌種再重復(fù)進行分離、純化2~3次[7，10-11]，從而得到較為純凈的菌種，并用蒸餾水法保存.

1.3 IOB最佳碳源和最佳氮源的確定

將得到的IOB接種到裝有不同碳源和氮源鑒定培養(yǎng)基的試管中進行篩選實驗[7].參照《工業(yè)循環(huán)冷卻水中菌藻的測定方法第6部分：鐵細(xì)菌的測定MPN法》[12]，測定鐵細(xì)菌的數(shù)量來反映其生長情況.

（1）最佳碳源的確定：將生長特性基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]中的檸檬酸鐵銨按1%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加，在此基礎(chǔ)上分別以碳含量相同的不同碳源代替檸檬酸鐵銨，測定鐵細(xì)菌數(shù)量.

（2）最佳氮源的確定方法：將生長特性培養(yǎng)基中的NaNO3按0.2%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行添加，在此基礎(chǔ)上分別以氮含量相同的不同氮源代替NaNO3，測定鐵細(xì)菌數(shù)量.

1.4 開路電位和極化電阻的測定

采用CS2350電化學(xué)工作站，在30℃±1℃條件下進行測試.采用傳統(tǒng)三電極體系，Q235碳鋼為工作電極，飽和甘汞電極作參比電極，大面積鉑電極作輔助電極.電位基本穩(wěn)定后對自腐蝕電位進行測試.極化電阻的測定采用電動掃描法，掃描速率為1 mV/s（電流-60~-150 μA），利用儀器自帶CView軟件采用線性區(qū)域進行計算.

1.5 腐蝕掛片試驗

將2塊經(jīng)過除油、紫外線滅菌的Q235標(biāo)準(zhǔn)腐蝕掛片分別懸掛于2個250 mL具塞三角瓶中，瓶中均裝滿經(jīng)過121℃滅菌的液體培養(yǎng)基，并用40 nm無菌濾膜密封，在30℃下培養(yǎng)5 d，將其中1瓶按5%接種量接種鐵細(xì)菌液、另1瓶不做任何處理后，仍密封置于30℃培養(yǎng)；30 d后取出掛片，清洗、干燥后用XL-30TMP型環(huán)境掃描電子顯微鏡（EMES）對碳鋼掛片腐蝕的表面形貌及能譜進行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳碳源的確定

以葡萄糖、蔗糖、甘油、乳糖、檸檬酸鈉、草酸鈉、半乳糖及可溶性淀粉為碳源，對IOB進行培養(yǎng)，經(jīng)實驗分析確定鐵細(xì)菌能夠利用的碳源包括：葡萄糖、蔗糖、甘油、乳糖、檸檬酸鈉.選擇其中較為常用的碳源，并通過測定鐵細(xì)菌數(shù)來確定各種碳源利用的程度，確定最佳碳源.圖1所示為不同碳源下IOB的數(shù)量變化情況.

由圖1可以看出，當(dāng)添加碳源為檸檬酸鐵銨時，鐵細(xì)菌數(shù)量最大；碳源為甘油、葡萄糖時次之；碳源為蔗糖、檸檬酸鈉、乳糖時，鐵細(xì)菌生長較為緩慢.將碳源為檸檬酸鐵銨的鐵細(xì)菌數(shù)量計為100%，計算其他各種碳源下鐵細(xì)菌數(shù)量的相對百分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明：甘油、葡萄糖的相對百分?jǐn)?shù)較高，分別為94.1%和88.2%；而蔗糖的相對百分?jǐn)?shù)為58.8%，乳糖、檸檬酸鈉的均不足50%.由此可見，鐵細(xì)菌對不同碳源利用能力的順序為：檸檬酸鐵銨>甘油>葡萄糖>蔗糖>檸檬酸鈉>乳糖.因此，鐵細(xì)菌最適宜碳源為檸檬酸鐵銨.這是由于鐵細(xì)菌一般生活在含氧量少但溶有較多鐵質(zhì)及二氧化碳的弱酸性水體中，檸檬酸鐵銨更能促進微生物生長的原因可能是檸檬酸鐵銨能夠分解出鐵離子，從而促進鐵細(xì)菌的生長，增加對碳源的利用.

圖1 不同碳源下IOB的生長情況Fig.1 Growth state of IOB cultured by different carbon sources

2.2 最佳氮源的確定

圖2所示為不同氮源下IOB的數(shù)量變化情況.

圖2 不同氮源下IOB的生長情況Fig.2 Growth state of IOB cultured by different nitrogen sources

由圖2可以看出，氮源為NaNO3時鐵細(xì)菌數(shù)量最大；氮源為NH4NO3、（NH4）2SO4、尿素時次之；氮源為KNO3時，鐵細(xì)菌數(shù)量最少.將氮源為NaNO3的鐵細(xì)菌數(shù)量計為100%，計算其他氮源下鐵細(xì)菌數(shù)量的相對百分?jǐn)?shù).結(jié)果表明：氮源為NH4NO3、（NH4）2SO4時，相對百分?jǐn)?shù)均為77.8%；氮源為尿素時，相對百分?jǐn)?shù)為66.7%；當(dāng)?shù)礊镵NO3時，只有24.4%.因此，鐵細(xì)菌對不同氮源的利用能力順序為：NaNO3>NH4NO3≈（NH4）2SO4>尿素>KNO3，最適宜的氮源為NaNO3.這主要是因為NaNo3為氮源時IOB的產(chǎn)酶量較高，此時IOB的微生物活性相對更強[9].

2.3 pH值對IOB生長的影響

在30℃利用生長特性基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，只改變pH值的情況下，鐵細(xì)菌生長數(shù)量隨著pH值變化的情況如圖3所示.

圖3 pH值對IOB生長的影響Fig.3 Effect of pH value on growth of IOB

由圖3可以看出，在pH值為6.5~7.5的范圍內(nèi)，鐵細(xì)菌能保持較高的數(shù)量；在pH值為7.0時，鐵細(xì)菌數(shù)量最大，達到7.0×106個/mL.pH會影響鐵細(xì)菌的生物活性.鐵細(xì)菌好氣，嗜中性和弱酸性環(huán)境，且在堿性條件下不易生長.實驗結(jié)果的最佳pH值范圍支持了這一理論.

2.4 IOB生長過程中碳鋼的電化學(xué)指標(biāo)

利用電化學(xué)工作站對30℃時碳鋼電極在接種有鐵細(xì)菌的液體培養(yǎng)基中的開路電位、極化電阻、腐蝕率隨時間的變化趨勢進行測定，結(jié)果如圖4所示.

由圖4可以看出，在無菌溶液中碳鋼電極的開路電位保持在-0.65 V左右，其極化電阻和腐蝕率也分別保持在1 230 Ω/cm2和0.25 mm/a不變.在有菌溶液中，開路電位和極化電阻都是在接種鐵細(xì)菌后先變大再變小，最終分別保持在-0.72 V和950 Ω/cm2不變；其腐蝕率先變小后變大最終保持在0.32 mm/a左右，最終有菌溶液的腐蝕速率保持在無菌溶液的1.28倍左右.由此可知：在接種鐵細(xì)菌后碳鋼的腐蝕先降低，這是因為培養(yǎng)基本身對碳鋼的腐蝕較小，金屬表面形成一層有機覆蓋層，剛接種時鐵細(xì)菌少，細(xì)菌處于增長期，代謝產(chǎn)物生成速率慢，此時電極表面覆蓋的生物膜致密，對電極產(chǎn)生一定的保護作用[13].但是隨著時間的進一步推進，碳鋼的腐蝕速率逐漸增加，最終超過無菌電解池碳鋼的腐蝕速率，并保持不變.這主要是因為鐵細(xì)菌達到一定數(shù)量后，可以比較穩(wěn)定地進行新陳代謝活動，增大了反應(yīng)動力，促進了碳鋼的腐蝕.

2.5 IOB對掛片形貌影響的ESEM分析

通過觀察發(fā)現(xiàn)，在無菌培養(yǎng)液中的掛片表面平整；而有菌培養(yǎng)液中的掛片表面顏色變化很大，部分區(qū)域接近鐵銹的顏色，且該區(qū)域內(nèi)有一些點狀凹陷的腐蝕坑，為鐵細(xì)菌促進碳鋼點蝕所致.有菌培養(yǎng)液中的掛片發(fā)生點蝕主要與碳鋼表面生物膜覆蓋不均勻和代謝產(chǎn)物有關(guān)[14].進一步應(yīng)用ESEM對無菌和接種有鐵細(xì)菌的培養(yǎng)液中的掛片進行形貌分析.掛片在培養(yǎng)液中放置30 d后的ESEM圖片如圖5所示.

圖4 IOB對相應(yīng)電化學(xué)指標(biāo)的影響Fig.4 Influence of IOB on electrochemical index

圖5 Q235碳鋼在培養(yǎng)基中30d后的腐蝕表面微觀形態(tài)Fig.5 Micrographs of corrosion product formed by carbon steel immersed 30 d in medium

由圖5可以看出，無菌培養(yǎng)液中的掛片表面存在一些分布比較均勻、形狀以圓形居多的平滑凸起，并沒有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)；而有菌培養(yǎng)液中的掛片表面存在2種形態(tài)顯著不同的結(jié)構(gòu)，一種是表面粗糙的球狀結(jié)構(gòu)，另一種則是片層結(jié)構(gòu).Duan等[15]在研究海水自然水體的微生物膜引起的碳鋼腐蝕時也發(fā)現(xiàn)了這2種結(jié)構(gòu)，認(rèn)為此種片狀結(jié)構(gòu)是一種鐵氧化物，可能包含F(xiàn)eCO3成分.

2.6 IOB對碳鋼腐蝕的元素分析

針對圖5電鏡掃描圖，對無菌、接種有鐵細(xì)菌的培養(yǎng)基中的碳鋼掛片采用能譜進行元素成分及含量分析，所獲得的能譜圖如圖6所示，表1所示為腐蝕產(chǎn)物環(huán)境掃描電鏡的能譜測試結(jié)果.

圖6 培養(yǎng)液中掛片能譜圖Fig.6 EDS spectra of carbon steel coupons in medium

表1 腐蝕產(chǎn)物環(huán)境掃描電鏡能譜測試結(jié)果（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）Tab.1 Result of EDS spectra of carbon steel corrosion product（percentage of quality）

由圖6和表1可以看出，無論有菌還是無菌培養(yǎng)液中的碳鋼掛片，其表面主要物質(zhì)均為鐵氧化物，但各掛片表面的元素含量有所不同.與無菌培養(yǎng)液中的掛片相比，有菌培養(yǎng)液中的掛片球狀和片狀結(jié)構(gòu)中O、P含量均有所增加，F(xiàn)e含量均有所下降.這是由于O、P等元素是微生物細(xì)胞、代謝產(chǎn)物的主要組成元素，由于微生物細(xì)胞及代謝產(chǎn)物的附著而導(dǎo)致O、P等元素含量的增加.鐵細(xì)菌會使Fe元素被氧化成Fe2+、Fe3+離子并從金屬表面游離出來，因此導(dǎo)致掛片表面Fe的含量減少.對于有菌培養(yǎng)液中的掛片表面兩種腐蝕結(jié)構(gòu)元素組分的差異，可能是由掛片表面生物膜分布不均勻造成的.

綜上所述，IOB的參與可明顯影響碳鋼掛片的元素成分及含量，使金屬的腐蝕加重.

3 結(jié)論

（1）IOB對不同碳源的利用能力順序為：檸檬酸鐵銨>甘油>葡萄糖>蔗糖>檸檬酸鈉>乳糖，鐵細(xì)菌的最適宜碳源為檸檬酸鐵銨.

（2）IOB對不同氮源的利用能力順序為：NaNO3> NH4NO3≈（NH4）2SO4>尿素>KNO3，最適宜的氮源為NaNO3.

（3）IOB最適宜的pH值范圍為6.5~7.5，最佳pH值為7.0.

（4）鐵細(xì)菌促進了碳鋼微生物腐蝕的發(fā)生，并且使掛片發(fā)生點蝕，這主要與生物膜分布不均勻和代謝產(chǎn)物有關(guān).

（5）IOB能使掛片腐蝕表面產(chǎn)生球狀（可能包含腐蝕產(chǎn)物FeCO3）和片狀兩種不同的結(jié)構(gòu)，并且兩種結(jié)構(gòu)的元素成分有所差異，可能與生物膜在電極表面覆蓋不均勻和代謝產(chǎn)物有關(guān).

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