李紅國(guó)，劉雙萍，崔銀姬，李柱虎

(延邊大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研部， 吉林 延吉 133002)

A.control group；B.experiment group in 48 hours(25 μmol/L)；C.experiment group in 72 hours(25 μmol/L)

木脂素促進(jìn)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡

李紅國(guó)，劉雙萍，崔銀姬，李柱虎*

(延邊大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研部， 吉林 延吉 133002)

木脂素(lignans)是一類由苯丙素氧化聚合而成的天然產(chǎn)物，多以二聚體的形式存在，少數(shù)為三聚體和四聚體。木脂素類化合物具有廣泛的生物活性[1]，如抗腫瘤、抗氧化、降壓、鎮(zhèn)靜和保肝等。

目前，木脂素對(duì)胃癌細(xì)胞抗增殖及機(jī)制方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)木脂素對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響與Bax和Bcl-2等蛋白之間的相關(guān)性的研究，初步探討木脂素對(duì)胃癌細(xì)胞的抗增殖作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人胃癌MGC-803細(xì)胞系。

1.1.2 主要試劑：木脂素由延邊大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研部提供(純度為99.9%，化學(xué)名稱為內(nèi)消旋二氫愈創(chuàng)木脂酸，meso-dihydroguaiaretic acid)；Bax和Bcl-6單克隆抗體(Santa Cruz公司)；Bcl-2單克隆抗體(碧云天生物技術(shù)研究所)；ABC免疫組化檢測(cè)試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞生存率的檢測(cè)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于下列實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞數(shù)為3×104個(gè)/孔，采用MTT方法。細(xì)胞生存率(%) = 實(shí)驗(yàn)組吸光值/對(duì)照組吸光值 ×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.2 檢測(cè)Bax、Bcl-2和Bcl-6蛋白的表達(dá)：用ABC免疫組化檢測(cè)試劑盒。實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。Bax、Bcl-2和Bcl-6抗體的稀釋比例均為1∶50。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果判定根據(jù)Bax以胞質(zhì)呈棕褐色為陽(yáng)性；Bcl-2和Bcl-6以胞核呈棕黃色為陽(yáng)性。陽(yáng)性表達(dá)率(%)=陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.3 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的檢測(cè)：采用流式細(xì)胞技術(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 透射電鏡觀察：胃癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生存率的檢測(cè)結(jié)果:不同濃度的木脂素處理的MGC-803胃癌細(xì)胞的生存率呈濃度和時(shí)間依賴性降低(Plt;0.05)。其IC50值為24.8 μmol/L(表1)。

表1 不同濃度木脂素在不同時(shí)間段對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞存活率的影響

*Plt;0.05，**Plt;0.01 compared with control group.

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)的檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 Bax、Bcl-2和Bcl-6蛋白的檢測(cè)結(jié)果(表2，圖1)。

2.2.2 細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果：48和72 h對(duì)照組凋亡率分別為2.3%±0.4%和2.3%±0.4%，25 μmol/L濃度木脂素處理的實(shí)驗(yàn)組凋亡率分別為15.5%±1.6%和19.8%±2.5%(Plt;0.01)。對(duì)照組G1期、G2期和S期細(xì)胞百分

A1.expression of Bax protein was weakly positive in control group；A2.expression of Bax protein was strong positive in experiment group；B1.expression of bcl-2 protein was strong positive in control group；B2.expression of Bcl-2 protein was weakly positive in experiment group；C1.expression of Bcl-6 protein was Strong positive in control group；C2.Expression of Bcl-6 protein was negative in experiment group

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)MGC-803細(xì)胞Bax、Bcl-2和Bcl-6蛋白表達(dá)的影響

*Plt;0.01 compared with control group.

A.control group；B.experiment group in 48 hours(25 μmol/L)；C.experiment group in 72 hours(25 μmol/L)

圖2流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響
Fig2Detectedtheeffectofapoptosisandcellcyclebyflowcytometry(FCM)

比為54.4%、13.6% 和32.0%；實(shí)驗(yàn)組48 h時(shí)為62.1%、8.0%和30.0%；72 h時(shí)為60.7%、12.5%和26.3%(圖2)。

2.2.3 透射電鏡觀察結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組MGC-803胃癌細(xì)胞形成凋亡小體，呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞典型的形態(tài)學(xué)改變(圖3)。

A.control group gastric carcinoma cell(×6 000)；B.experiment group gastric carcinoma cell (×8 000)圖3 透射電鏡觀察胃癌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化Fig 3 Observation on morphological changes of gastric cacinoma cells using a transmission electron microscope

3 討論

木脂素在自然界分布廣泛，研究表明木脂素具有明顯的抗腫瘤作用[2]。木脂素對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

本研究結(jié)果表明，木脂素對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞具有明顯的抗增殖作用，并具有濃度和時(shí)間依賴性。細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組凋亡率與對(duì)照組相比有顯著性差異，說(shuō)明，木脂素可促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，木脂素可下調(diào)Bcl-2和Bcl-6蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，表明木脂素通過(guò)Bcl-2/Bax蛋白及Bcl-6蛋白的調(diào)控來(lái)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)組G1期細(xì)胞百分比增多，而S期及G2期細(xì)胞百分比減少，說(shuō)明，木脂素可阻止細(xì)胞從細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

[1] Chiu HF, Chen TY, Tzeng YT,etal. Improvement of liver function in humans using a mixture of schisandra fruit extract and sesamin[J]. Phytother Res, 2013,27:368-373.

[2] Jeong JB, Hong SC, Jeong HJ,etal. Arctigenin induces cell cycle arrest by blocking the phosphorylation of Rb via the modulation of cell cycle regulatory proteins in human gastric cancer cells[J]. Int Immunopharmacol, 2011,11:1573-1577.

2013-07-21

2013-10-25

吉林省教育廳項(xiàng)目[吉教科合字(2009)第4號(hào)]

*通信作者(correspondingauthor)： lizh@ybu.edu.cn

1001-6325(2014)05-0704-03

R 361+.1

A