田名洋，李 青，趙云紅，馬遵平，劉玉琴，許 峰，黃 波*

(1.遵義市第一人民醫(yī)院 兒科, 貴州 遵義 563000；2.重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬兒童醫(yī)院 兒童重癥醫(yī)學(xué)科, 重慶 400014)

P物質(zhì)減輕高氧誘導(dǎo)新生大鼠肺損傷

田名洋1，李 青1，趙云紅1，馬遵平1，劉玉琴1，許 峰2，黃 波1*

(1.遵義市第一人民醫(yī)院 兒科, 貴州 遵義 563000；2.重慶醫(yī)科大學(xué) 附屬兒童醫(yī)院 兒童重癥醫(yī)學(xué)科, 重慶 400014)

搶救早產(chǎn)兒呼吸衰竭最常用的措施是氧氣療法，持續(xù)高氧治療可導(dǎo)致新生兒尤其是早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良，是一種肺氧化應(yīng)激性損傷的疾病。神經(jīng)肽P物質(zhì)(substance P, SP)是速激肽家族最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽，其在肺損傷修復(fù)中的作用還無研究，本研究將從整體動物水平研究神經(jīng)肽SP對高氧暴露肺損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑：一抗(Cell Signaling Technology公司)，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，TUNEL檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，按說明書操作。32只清潔級SD雌性大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[動物合格證號：SYXK(渝)2007-0016]，共分為8組，每組4只雌鼠，并放入1只雄鼠過夜，次日清晨檢查陰栓，并將孕鼠分籠飼養(yǎng)，于21 d時行剖宮產(chǎn)取出早產(chǎn)鼠。

1.2 分組與建模：6窩早產(chǎn)大鼠出生1 d的仔鼠48只，分為4組，每組12只，對照組、SP干預(yù)組(SP組)、高氧(hyperoxia, hyper組)及SP干預(yù)高氧組(hyper+SP組)，hyper組和hyper+SP組持續(xù)暴露于高氧中連續(xù)3 d或7 d，SP組和hyper+SP組每天給予腹腔注射SP 1 μmol/L/(kg·d)，另外兩組給于等體積的0.9%氯化鈉注射液。高氧組早產(chǎn)鼠暴露在氧箱(90 cm×60 cm×50 cm) 內(nèi)，氧流量5 L/min，維持氧濃度在85%左右，室溫維持在25 ℃左右，晝夜各12 h，自由飲水和進(jìn)食，每日上午9時開箱10 min清掃。

1.3 標(biāo)本制備和指標(biāo)檢測：全部動物于出生后3、7d取出肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)進(jìn)行切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4 MDA、SOD和GSH水平的檢測：用預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液洗凈余下右肺組織，吸干水分，稱1 g濕質(zhì)量肺組織剪碎，于冰盒內(nèi)超聲粉碎勻漿，制成10% 組織勻漿，4 ℃ 3 000r/min離心10 min后取上清液，按照南京建成生物工程研究所提供試劑盒要求，分別采用硫代巴比妥酸法、亞硝酸鹽法檢測，二硝基苯甲酸法用分光光度劑依次在532、550和422 nm處測定其吸光度(A)值，用所給公式分別計算其質(zhì)量濃度。

1.5 采用末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡：實驗步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。取組織切片按常規(guī)方法脫蠟至水，加入蛋白酶K作液，21 ℃～37 ℃反應(yīng)15～30 min，30 mL/L H2O2室溫下(15 ℃～25 ℃)封閉10 min，滴加 50 μL TUNEL反應(yīng)混合液(酶反應(yīng)液與標(biāo)記液的比例為1∶9)濕盒中37 ℃避光濕潤反應(yīng)1 h。再滴加50 μL Converter2POD，濕盒中37 ℃避光濕潤反應(yīng)30 min，增敏二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果判斷：胞核呈現(xiàn)棕黃色為陽性細(xì)胞。

1.6 Western blot檢測ERK表達(dá)：稱取肺組織，加入改良細(xì)胞組織快速裂解液(RIPA)緩沖液裂解后提取蛋白，-20 ℃保存。二喹啉甲酸(BCA)比色法測定蛋白質(zhì)濃度。制膠，加樣，SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜(1∶1 000)，二抗(1∶2 500)孵育1 h，曝光，分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)比較：高氧組第3或第7天，肺表面見點片狀或斑片狀出血，切面見紅色泡沫樣液體滲出，肺泡內(nèi)有出血和大量滲出的炎性細(xì)胞，肺泡壁及肺泡嚴(yán)重水腫狀。SP干預(yù)組肺表面出血點明顯減少。

2.2 早產(chǎn)小鼠肺組織14 d SOD、MDA和GSH測定:高氧組第3或7天SOD和GSH的活力顯著降低 (Plt;0.05)，而MAD

的活力則顯著增強(Plt;0.05)。SP干預(yù)之后，與高氧組比較有顯著的改善(表1)。

2.3 高氧肺損傷或SP干預(yù)后肺細(xì)胞凋亡指數(shù)和ERK的變化:第7天高氧組肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extra cellular regulated protein kinases, ERK)的表達(dá)顯著高于對照組(Plt;0.05)。SP干預(yù)后顯著降低(Plt;0.05)，但仍高于對照組(Plt;0.05) (圖1,表2)。

表1 早產(chǎn)小鼠肺組織3,7 d SOD,MDA,GSH測定Table 1 Detection of SOD, MDA content and GSH activities in lung tissue of neonatal rats

*Plt;0.05 compared with control;#Plt;0.05 compared with hyperoxia.

A.control; B.SP; C.hyperoxia; D.hyper+SP圖1 第3或7天后檢測各組TUNEL染色結(jié)果和ERK蛋白表達(dá)情況Fig 1 Detection of apoptotic cell by TUNEL staining (%) and expression of ERK in four groups after 3 or 7 day

groupTUNEL-positivecells(%)ERK/β-actincontrol 8.8±1.9 1.00±0.18SP 9.4±2.2 1.30±0.17hyperoxia 54.8±7.5* 3.10±0.42*hyper+SP 37.2±6.1*# 2.20±0.25*#

*Plt;0.05 compared with control；#Plt;0.05 compared with hyperoxia.

3 討論

研究表明SP在修復(fù)細(xì)胞的遷移、分化及增殖方面都有重要作用[1]，在氣道損傷、燒傷修復(fù)的患者血漿P物質(zhì)均明顯升高[2]，SP對平滑肌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞均有明顯的促增殖分化的作用[3]。本研究發(fā)現(xiàn)，SP干預(yù)后可減少高氧所致的肺損傷，減輕高氧帶來的氧化損傷，有助于維持細(xì)胞的正常生理功能，保護氧化應(yīng)激狀態(tài)下肺損傷細(xì)胞。高氧暴露下很快誘導(dǎo)ERK信號表達(dá)，使用SP干預(yù)能明顯降低高氧暴露下ERK信號的過度活化，同時減少細(xì)胞凋亡和改善氧化應(yīng)激失衡的狀態(tài)，提示SP干預(yù)后可抑制ERK信號通路的激活從而減輕高氧肺損傷。

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2013-11-25

2014-03-17

遵義市科學(xué)技術(shù)局科技項目[遵市科合社志(2011)22號]；貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目[黔科合J字(20112)341號]

*通信作者(correspondingauthor)： 672879381@qq.com

1001-6325(2014)05-0701-03

R 563

A