李 博，王元?jiǎng)?，?娟，湯海峰，程 光*

(第四軍醫(yī)大學(xué) 西京醫(yī)院 1.神經(jīng)外科； 2.藥劑科，陜西 西安 710032)

研究論文

白頭翁皂苷D誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞凋亡

李 博1，王元?jiǎng)?，李 娟1，湯海峰2，程 光1*

(第四軍醫(yī)大學(xué) 西京醫(yī)院 1.神經(jīng)外科； 2.藥劑科，陜西 西安 710032)

目的探討白頭翁皂苷D對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87的增殖抑制和促凋亡效應(yīng)及其機(jī)制。方法用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制作用，并求得IC25、IC50和IC75，按濃度和時(shí)間分組，Annexin-Ⅴ/PI雙染、流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL/PI染色檢測(cè)凋亡，Hoechst33342染色、透射電子顯微鏡、DNA-ladder檢測(cè)細(xì)胞系改變，細(xì)胞免疫染色和Western blot檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)。結(jié)果白頭翁皂苷D在14.016 nmol/mL下對(duì)U87MG抑制率為94.034%(Plt;0.05)；處理組細(xì)胞形態(tài)呈凋亡改變，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)自噬小體；處理組caspase-3、8、Bax和FasL表達(dá)上調(diào)(Plt;0.05)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)(Plt;0.05)。結(jié)論白頭翁皂苷D對(duì)U87MG細(xì)胞有呈時(shí)間和濃度依賴的增殖抑制作用，且通過FasL/Fas途徑誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

白頭翁皂苷D；增殖抑制；凋亡；細(xì)胞周期

神經(jīng)系統(tǒng)中，惡性膠質(zhì)瘤是最常見的一種腫瘤[1]。其過高的患病率及極短的中位生存期，給社會(huì)尤其是患者家庭帶來較大的負(fù)擔(dān)。白頭翁湯有清熱解毒、明目、消贅和止痢的功效[2]。白頭翁皂苷D

在前期單體藥物篩選中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力。本實(shí)驗(yàn)觀察白頭翁皂苷D對(duì)U87MG的增殖抑制作用和致凋亡機(jī)制，為其作為臨床抗腫瘤新藥提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人源性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤系U87MG、EVC304細(xì)胞、正常星形膠質(zhì)細(xì)胞(美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)，ATCC)。

太白銀蓮花(anemone taipaiensis)提取物單體W-6即白頭翁皂苷D(pulsatilla saponin D)由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科提供，純度達(dá)98%以上。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:U87MG、EVC304細(xì)胞置于10%胎牛血清、0.2% NaHCO3、0.3%羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)的DMEM培養(yǎng)基中，于恒濕孵箱中培養(yǎng)；NA細(xì)胞置于20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。MTT中，按0.219、0.438、0.876、1.752、3.504、7.008、14.016和28.032 nmol/mL濃度梯度設(shè)定，U87MG處理24和72 h，EVC304和NA處理72 h；設(shè)定空白對(duì)照組；設(shè)定DMSO組；每組5個(gè)副孔。求得IC25、IC50及IC75值。

1.2.2 樣品的制備：純度大于98%的白頭翁皂苷D晶體被二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解，制成1 000 μmol/L的貯存液，于-20 ℃保存。使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，且DMSO含量小于5‰。

1.2.3 MTT法檢測(cè)U87MG細(xì)胞增殖: 取0.5 g MTT粉劑，溶解于100 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中。將U87MG、EVC304和NA細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋成2×104/mL的懸液；加入96孔培養(yǎng)板。加入20 μL MTT液；加DMSO后微振蕩；在490 nm下，測(cè)定板內(nèi)吸光度(absorbance，A)值；除去調(diào)零組A值，以公式[抑制率=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%]；求得每組A值，6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析并求得U87MG的IC25、IC50和IC75值。

1.2.4 Hoechst33342染色檢測(cè)細(xì)胞系改變：將U87MG及EVC304細(xì)胞種植于24孔培養(yǎng)板。因化療藥物多采用靜脈滴注，故EVC304作為陽(yáng)性對(duì)照組；加藥處理后，PBS洗滌，每孔加入0.5 mL Hoechst33342染液，避光孵育15 min；熒光顯微鏡下檢測(cè)。

1.2.5 Annexin-Ⅴ/PI 染色標(biāo)記凋亡細(xì)胞：按IC25、IC50和IC75，用白頭翁皂苷D處理U87MG細(xì)胞12 h；吸取100 μL細(xì)胞到1.5 mL離心管中，加入5 μL的Annexin-Ⅴ-FITC和5 μL的PI染色；避光混勻，在室溫下孵育15 min；流式送檢。

1.2.6流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：70%的冰乙醇與PBS制備單細(xì)胞懸液；PBS洗滌并重懸，4 ℃過夜；用RNaseⅠ(0.1 mg/mL)和PI(40 μg/mL)在37 ℃孵育30 min；上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 透射電子顯微鏡技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：U87MG細(xì)胞在IC50濃度下處理12和16 h；收集細(xì)胞懸液，1 000r/min離心；3%的戊二醛4℃固定；10 g/L鋨酸固定；后脫水、包埋、超薄切片和雙染色(鉛/鈾)；透射電鏡下觀察。

1.2.8 TUNEL/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡：制備5×103/mL細(xì)胞懸液，加入放有蓋玻片的6孔板內(nèi)；加入IC50；分別處理12和16 h； 0.4%的多聚甲醛固定30 min； 0.3% H2O2避光處理20 min；Triton X-100(0.15%)破膜；滴加TUNEL混合物(1∶9)；在37 ℃避光潮濕條件下孵育1 h；再加入PI(1∶1 000)。熒光顯微鏡下觀察。

1.2.9 DNA-ladder檢測(cè)DNA片段：本實(shí)驗(yàn)采用羅氏公式的DNA-ladder檢測(cè)試劑盒；按IC50、IC75分別處理U87MG 12和16 h；按照說明書，異丙醇法提取備用。制備瓊脂糖凝膠；在電壓80～100 V間電泳1 h；紫外光透射儀下觀察。

1.2.10 細(xì)胞免疫組化染色檢測(cè)caspase8表達(dá)：將細(xì)胞載玻片用0.15% Txiton X-100處理15 min,除去內(nèi)源性過氧化物酶,高壓抗原修復(fù),用SABC試劑盒中的血清經(jīng)行抗體封閉,按caspase8，1∶30(兔抗人)配制一抗,潮濕環(huán)境過夜。加二抗,滴加辣根過氧化物酶卵白素工作液,DAB顯色,中性樹脂封片。顯微鏡下觀察。

1.2.11 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)：制備蛋白,BCA(bicinchoninic acid)法蛋白定量。配制SDS-PAGE，在上層膠80 V、下層膠120 V下電泳45 min。在電壓100 V下轉(zhuǎn)膜90 min。取出硝酸纖維膜(NC膜)，用脫脂牛奶封閉1 h，以1∶300分別配制兔抗人的Bax/Bcl-2、Fas/Fas-L、LC-3和caspase3、8等，β-actin(1∶2 000)；4 ℃過夜；將NC條帶TBST洗滌；以1∶20 000配制二抗，將NC膜置于二抗液中，在室溫下孵育2 h； 增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色；圖像采集，β-actin為內(nèi)參照，Image行灰度分析。以各條帶的吸光度值與其相應(yīng)內(nèi)參照的吸光度值的比值作統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1白頭翁皂苷D對(duì)于人惡性膠質(zhì)細(xì)胞系U87MG的增殖影響

中等濃度時(shí)，白頭翁皂苷D對(duì)U87MG增殖抑制效果上升；高濃度梯度后，其抑制效果趨于平緩(圖1)。

2.2 凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)

2.2.1 Hoechst33342染色：熒光顯微鏡下，處理組U87MG細(xì)胞系呈新月型和車輪狀改變，偶可見凋亡小體，呈典型凋亡形態(tài)表現(xiàn)，呈時(shí)間和濃度依賴。 陽(yáng)

*Plt;0.05 compared with low concentration group圖1 白頭翁皂苷D對(duì)U87MG、EVC304和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞(NA)的增殖抑制Fig 1 The proliferation inhibition of the U87MG, EVC304 and NA by the Pulsatilla saponin D(n=6)

性對(duì)照組EVC304胞核形態(tài)未見異常(圖2A)。

2.2.2 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：處理組細(xì)胞微絨毛消失，胞質(zhì)固縮、可見大量溶酶體，胞核濃聚、邊集，呈新月形或者車輪狀改變，核仁消失。對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)完整，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞器未見明顯變化，核仁明顯。同時(shí)，處理組中觀測(cè)到呈雙膜結(jié)構(gòu)、含有部分殘留細(xì)胞體的自噬體(圖2B)。

A.as the action time and concentration transformation, EVC304 was the positive control group, showed typical nuclear shape(×200); B.typical morphological change of apoptosis(×10 000) and the autophagy(×50 000)

圖2Hoechst33342染色、透射電鏡觀察白頭翁皂苷D誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞改變
Fig2ThechangingandultrastructureofU87MGcellsunderthefluorescencemicroscopeandelectronmicroscope

A.the 12 hours group under the IC50 and IC75 with the TUNEL/PI staining (×200); B.the statistical analysis; *Plt;0.01 compared with control

2.2.3 TUNEL/PI染色檢測(cè)凋亡細(xì)胞：TUNEL處理后的凋亡細(xì)胞在激發(fā)光下顯綠色；PI染色后，膜破損的胞核在激發(fā)光下顯紅色；圖片疊加后采集(圖3)。參考Giudice計(jì)算細(xì)胞凋亡。

2.3 DNA-ladder檢測(cè)凋亡片段

處理組電泳條帶呈梯狀改變，IC50組凋亡片段集中在500～700 bp之間，IC75組集中在100～200 bp之間(圖4)。

2.4 AnnexinⅤ/PI法檢測(cè)凋亡

處理組凋亡比例隨濃度的提高而顯著高于對(duì)照組(Plt;0.01)(表1)。

早期凋亡和晚期凋亡占每樣本所檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)隨著濃度的增加而增加，晚期凋亡在IC50時(shí)，其達(dá)到了(54.00±0.37)%(圖5A,B)。

2.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞凋亡的典型特征“亞G1峰”出現(xiàn)，并隨著濃度梯度的增加而升高；G0/G1期細(xì)胞所占比例相對(duì)增加，S期和G2/M期無明顯變化規(guī)律(圖5C，D)。

The result of the the apoptosis segments of U87MG cells disposed 12 hours by the Pulsatilla saponin D; M.DNA marker; C.control圖4 DNA電泳顯示凋亡片段Fig 4 DNA-ladder showed the apoptosis segments

2.6 細(xì)胞免疫組化檢測(cè)caspase-8表達(dá)

處理組胞質(zhì)呈棕黃色，胞核為藍(lán)紫色，細(xì)胞形態(tài)皺縮；對(duì)照組中未見胞質(zhì)深染，僅有胞核著色；U87MGcaspase-8陽(yáng)性率表達(dá)隨著藥物作用濃度的升高而升高(圖6)。

表1 FITC-AnnexinⅤ/PI法檢測(cè)U87MG凋亡(%)Table 1 FITC-AnnexinⅤ/PI be used to detected the apoptosis of U87MG(n=3,s=0.01)

A.the apoptosis of U87MG cells; B.the cell cycle of U87MG cells, the green part was the SubG1 DNA content,C,D.the statistical analysis; *Plt;0.01 compared with control group

A.the expression of caspase-8 for the 12 hours group treated with IC50 and IC75(×200)；B.the statistical analysis;*Plt;0.01 compared with control group

2.7白頭翁皂苷D上調(diào)U87MG細(xì)胞caspase-8、caspase-3、Bax及Fas-L和下調(diào)Bcl-2的表達(dá)

Caspase-8、caspase-3、Bax、Fas-L蛋白表達(dá)量明顯上升，Bcl-2表達(dá)下調(diào)(圖7)

3 討論

近年來在體外研究時(shí)發(fā)現(xiàn)人參皂苷[3]、白藜蘆醇[4]、土貝母皂苷和紫杉醇等對(duì)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的致凋亡作用。惡性膠質(zhì)瘤的現(xiàn)代診療手段雖取得進(jìn)展，但效果并不理想[5]。白頭翁皂苷D對(duì)鼠源性LLC(Lewis 肺癌)細(xì)胞體外增殖有抑制作用[6]，對(duì)直腸癌細(xì)胞有促凋亡作用[7]。

本實(shí)驗(yàn)首次研究白頭翁皂苷D對(duì)人腦惡性膠質(zhì)瘤的作用。白頭翁皂苷D對(duì)U87MG有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用，呈濃度和時(shí)間依賴；隨白頭翁皂苷D濃度的遞增，U87MG增殖抑制明顯； EVC304、NA抑制率上升緩慢，且隨濃度變化起伏；故白頭翁皂苷D對(duì)于其細(xì)胞毒性作用較?。慌c其他化合單體[8]比較，白頭翁皂苷D在低濃度下就對(duì)U87MG有明顯的增殖抑制。

白頭翁皂苷D阻滯U87MG細(xì)胞周期。而細(xì)胞周期阻滯有可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或者其他[9]。細(xì)胞周期的調(diào)控與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、凋亡和腫瘤等都密切相關(guān)[10]。在U87MG中G0/G1期細(xì)胞數(shù)量隨著藥物濃度的增加而增加。Hoechest33342、透射電鏡、TUNEL/PI染色等發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷D對(duì)膠質(zhì)瘤U87MG有促凋亡作用。

*Plt;0.05 compared with control圖7 白頭翁皂苷D處理U87MG后相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig 7 The expression of Fas-L,Bcl-2,Bax,caspase-3,8 and β-actin(n=3)

白頭翁皂苷D對(duì)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用是通過AKT/mTOR 信號(hào)通路[7]。細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)過程，其主要可以分為三條路徑，即依賴線粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的凋亡通路、死亡受體介導(dǎo)的凋亡通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。caspase家族在細(xì)胞凋亡中有舉足輕重的作用。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)，caspase-3、8的表達(dá)水平隨著藥物作用濃度的增加而顯著增高。Bcl-2為抑制凋亡蛋白，當(dāng)細(xì)胞DNA受到損傷后，黏附在線粒體上的Bcl-2可以阻止線粒體膜上通透轉(zhuǎn)換孔打開，從而抑制凋亡的級(jí)聯(lián)發(fā)生[11]。Bax可以下調(diào)Bcl-2的表達(dá)， Bax表達(dá)升高可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

在實(shí)驗(yàn)樣本(U87MG)的超微結(jié)構(gòu)中，可觀察到呈雙層膜結(jié)構(gòu)、內(nèi)含有部分胞質(zhì)或細(xì)胞器的自噬體。自噬和凋亡關(guān)系復(fù)雜，有復(fù)雜的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)又和周期停滯有部分聯(lián)系[12]。

經(jīng)過初步研究發(fā)現(xiàn)白頭翁皂苷D對(duì)U87MG有明確的增殖抑制和促凋亡作用，該機(jī)制可能和FasL/Fas通路有關(guān)。U87MG細(xì)胞發(fā)生自噬的作用有待進(jìn)一步證實(shí)。

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Pulsatilla saponin D induces cell apoptosis in the U87MG cells

LI Bo1, WANG Yuan-gang1, LI Juan1, TANG Hai-feng2, CHENG Guang1*

(1.Dept. of Neurosurgery, Neurosurgery Institnte of PLA;2.Dept. of Pharmacy, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

ObjectiveTo investigate the proliferation inbibition and apoptosis induction of the Pulsatilla saponin D on the human malignant glioma cell lines U87MGinvitro.MethodsThe proliferation-inhibiting effect and apoptosis of the U87MG cells treated with the different concentrations of the Pulsatilla Saponin D for different timesinvitrowere detected by MTT assay and the flow cytometry respectively. The cell apoptosis was examined by Hoshest 33342,the fluorescence fiber mirror,TUNEL/PI,DNA-ladder，and the apoptotic pathways were analysed by the Western blot analysis.ResultsThe proliferation inhibition of U87MG by Pulsatilla saponin D 14.016 nmol/mL was 94.034%(Plt;0.05). The nuclear shape of the U87MG cells was changed after treatment with Pulsatilla saponin D, and stained by Hoechst 33342 in a time-and-dose dependent manner. The total protein was extracted from the U87MG cells and the expression of the caspase-3,8,Bax and Fas-L were increased, while the level of Bax expression reduced. The level of Bcl-2 changed unobviously.ConclusionsPulsatilla saponin D can inhibit the proliferation of human malignant glioma cell lines U87MG with a time-dose dependent manner and induce the apoptosis of U87MG cells through the Fas/Fas-L pathway.

Pulsatilla saponin D; proliferation inhibition; apoptosis; cell cycle

2014-02-25

2014-03-13

國(guó)家自然科學(xué)基金(30873402)

*通信作者(correspondingauthor)：chg16801@163.com

1001-6325(2014)05-0654-07

R 739.41

A