張李鈺，胡 燕，曹蓓蓓，段金虹，劉 喆，楊先達(dá)*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 病理生理系，北京 100005；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 臨床遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

研究論文

新型CD20核酸適配體的篩選及鑒定

張李鈺1，胡 燕1，曹蓓蓓1，段金虹1，劉 喆2，楊先達(dá)1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 病理生理系，北京 100005；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 臨床遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005)

目的研發(fā)能特異性識別CD20分子的DNA適配體，使其作為腫瘤靶向分子為非霍奇金淋巴瘤的新型靶向治療提供依據(jù)。方法體外合成含有21個(gè)隨機(jī)寡核苷酸、全長為59個(gè)堿基的DNA文庫，以CD20胞外表位肽為靶標(biāo)，利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)，從文庫中篩選CD20適配體；利用流式細(xì)胞術(shù)評估適配體的富集程度、適配體與CD20多肽，適配體與CD20陽性細(xì)胞的結(jié)合特性；用MFold軟件預(yù)測適配體預(yù)計(jì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果經(jīng)多輪篩選獲得了能識別CD20結(jié)構(gòu)的全新DNA適配體CE4-1；它能特異性地識別CD20陽性淋巴瘤細(xì)胞，與白蛋白及CD20陰性細(xì)胞的結(jié)合較弱，與經(jīng)胰蛋白酶處理的CD20陽性細(xì)胞的結(jié)合也減弱。結(jié)論該新型適配體能選擇性識別CD20結(jié)構(gòu)及CD20陽性細(xì)胞，在CD20陽性淋巴瘤的靶向診療方面具有應(yīng)用潛能。

適配體；SELEX；CD20

非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)是最常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，發(fā)病率和病死率逐年上升[2]。靶向治療有可能改善腫瘤的治療效果，在NHL治療中得到重視[3]。靶向治療需要靶標(biāo)蛋白，CD20分子在95%以上的B細(xì)胞淋巴瘤中特異表達(dá)，而85%的NHL源于B細(xì)胞[4-5]，故CD20是治療多數(shù)NHL的理想靶點(diǎn)[6]。現(xiàn)有CD20靶向治療的抗體藥物(美羅華)有耐藥性等弊端，故需研發(fā)新的靶向分子[7]。核酸適配體(aptamer)是一類短鏈核酸分子，以較高特異性和親和力與靶標(biāo)結(jié)合，并易合成、低成本、易穿透腫瘤組織，是一類具有重大應(yīng)用潛能的腫瘤靶向分子[8]。而目前國內(nèi)外尚未研發(fā)出針對CD20的核酸適配體。本文以CD20胞外一段表位肽為靶標(biāo)，通過SELEX技術(shù)篩選得到了一種全新的CD20適配體(CE4-1)，并在體外分析了其結(jié)合特性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胎牛血清(FBS Hyclone公司); 1640干粉(Gibico公司)；血清白蛋白(BSA，Tbdscience公司)；單鏈DNA文庫 (Invitrogen公司)，由59個(gè)堿基構(gòu)成，兩端為固定序列，中間為21個(gè)堿基的隨機(jī)序列:5′-TGCGTGTGTAGTGTGTCTG-N21-CTCTTAG GGATTTGGGCGG-3′;引物P1:5′-TGCGTGTGTAGTG TGTCTG-3′、P2:5′-CCGCCCAAATCCCTAAGAG-3′、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記引物P1 和生物素(Biotin)標(biāo)記引物P2(Invitrogen 公司); Taq 酶，10×PCR 緩沖液，dNTP(Genestar 公司); CD20多肽(NIYNCEPANPSEKNSPSTQYCYSIQ，欣百諾生物公司);脲醛樹脂磁性微球Affimag UF(表面基團(tuán)為-COOH)(天津倍思樂公司); 鏈霉親和素分離磁珠(Promega公司); 碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)(Sigma公司); pEASY-T1 克隆載體試劑盒(全式金公司)。其余藥品、試劑均為國產(chǎn)分析純等級。

1.2 細(xì)胞系

Raji和Ramos(均人B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系)及Jurkat(人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系)(均中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心)。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含有10% 胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5% CO2。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均處于增殖期細(xì)胞。

1.3 SELEX過程

1.3.1 CD20多肽與UF磁珠偶聯(lián)：將5×105個(gè)UF磁珠在碳二亞胺EDC/N-N-羥基琥珀酰亞胺NHS(0.1 mol /L)作用下室溫催化激活15 min。PBS洗2遍，將1 μg CD20多肽與已激活的磁珠混合，室溫震搖2 h。PBS洗2次，重懸，4 ℃保存?zhèn)溆?。血清白蛋白BSA與磁珠連接方法與CD20一致。

1.3.2 適配體篩選：取50 pmol DNA文庫，用緩沖液PBS稀釋到100 μL，95 ℃變性5 min，立刻放于冰上10 min。將預(yù)處理的DNA文庫與靶標(biāo)包被的磁珠孵育，振蕩30 min。利用磁場分離磁珠，棄上清液，PBS洗滌磁珠，重懸后在95 ℃熱水中加熱5 min，回收上清液。

1.3.3 PCR擴(kuò)增富集：將上清液作為模板，優(yōu)化PCR條件，硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記引物P1和生物素標(biāo)記引物P2擴(kuò)增雙鏈(95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共25個(gè)循環(huán))。

1.3.4 單鏈DNA的獲得：將PCR產(chǎn)物按照說明書與鏈霉親和素磁珠孵育，在堿性條件下得到單鏈DNA，用于下一步篩選或者檢測。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測并分析篩選進(jìn)程

將每輪篩選所得帶有FITC標(biāo)記的ssDNA庫與靶標(biāo)磁珠室溫孵育30 min，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測單鏈DNA與磁珠結(jié)合的熒光強(qiáng)度變化。

1.5 克隆測序

將富集的DNA文庫用未修飾的引物擴(kuò)增成雙鏈DNA。將1 μL PCR產(chǎn)物與1 μL克隆載體輕輕混勻，25 ℃反應(yīng)5 min。將連接產(chǎn)物于50 μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴20～30 min。42 ℃熱激30 s，立即置于冰上2 min。加250 μL室溫的SOC/LB，37 ℃孵育1 h。取200 μL菌液鋪板，培養(yǎng)過夜。挑取邊緣光滑的白色克隆至0.5 mL含氨芐和卡納霉素的細(xì)菌普通培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。用分離的單鏈產(chǎn)物和靶標(biāo)磁珠反應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測其與靶標(biāo)的結(jié)合能力，選擇結(jié)合能力強(qiáng)的克隆送公司測序。

1.6 適配體CE4-1二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

使用MFold 軟件預(yù)測適配體CE4-1的二級結(jié)構(gòu)。

1.7適配體CE4-1與多肽靶標(biāo)特異性結(jié)合的檢測

將FITC標(biāo)記的核酸適配體CE4-1分別與靶標(biāo)以及血清白蛋白包被的磁珠孵育，室溫振蕩30 min，洗2遍。用流式細(xì)胞儀分析磁珠表面的熒光強(qiáng)度。

1.8適配體CE4-1與CD20陽性細(xì)胞特異性結(jié)合的檢測

將FITC標(biāo)記的核酸適配體CE4-1分別與CD20陽性細(xì)胞Raji、Ramos以及CD20陰性細(xì)胞Jurkat孵育，搖床振蕩30 min，洗2遍。用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.9CD20陽性細(xì)胞表面CD20蛋白量對CE4-1與細(xì)胞結(jié)合的影響

FITC標(biāo)記的CE4-1分別與經(jīng)胰酶消化10 min的CD20陽性細(xì)胞以及未經(jīng)過胰蛋白酶處理的同種細(xì)胞進(jìn)行孵育，洗2遍后以流式檢測細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化。

2 結(jié)果

2.1 篩選富集過程

經(jīng)過SELEX篩選富集后，隨著篩選的進(jìn)程，富集庫中ssDNA對CD20結(jié)合增強(qiáng)，曲線右移。將最后一輪篩選庫進(jìn)行克隆，從96個(gè)克隆中篩選到一個(gè)對CD20有較強(qiáng)結(jié)合的適配體CE4-1(圖1)。其序列為5′-TGCGTGTGTAGTGTGTCTGTTTTTTATCTTC TTTTATCTACTCTTAGGGATTTGGGCGG-3′。圖2為利用MFold軟件預(yù)測的CE4-1的二級結(jié)構(gòu)。

2.2 適配體CE4-1與CD20的結(jié)合特異性評估

CE4-1與CD20結(jié)構(gòu)的結(jié)合遠(yuǎn)高于與裸磁珠的結(jié)合(圖3A)。而CE4-1與血清白蛋白的結(jié)合與裸磁珠相似，明顯弱于與CD20的結(jié)合(圖3B)。

圖1 流式細(xì)胞技術(shù)檢測篩選過程中適配體庫的富集Fig 1 Flow cytometry histograms for monitoring the enrichment of aptamers during the selection process

圖2 MFold軟件預(yù)測適配體CE4-1的二級結(jié)構(gòu)Fig 2 Predicted secondary structure of the aptamer CE4-1 by MFold software

比較各組平均熒光強(qiáng)度值可見，CE4-1與CD20結(jié)合的平均熒光強(qiáng)度明顯高于與血清白蛋白的結(jié)合(圖3C)。

圖3 流式細(xì)胞技術(shù)檢測適配體CE4-1與CD20多肽(A)和血清白蛋白(B)的結(jié)合

A.CD20-positive cells Raji incubated with FITC-labeled CE4-1(gray curve) and random DNA(black curve); B.CD20-positive cells Ramos incubated with FITC-labeled CE4-1(gray curve) and random DNA(black curve); C.CD20-negative cells Jurkat incubated with FITC-labeled CE4-1(gray curve) and random DNA(black curve)

圖4流式細(xì)胞技術(shù)檢測適配體CE4-1與CD20陽性細(xì)胞和CD20陰性細(xì)胞的結(jié)合
Fig4FlowcytometryprofilesofCE4-1andrandomDNA’sbindingtotheCD20-positivecellsandCD20-negativecells

2.3適配體CE4-1與CD20陽性細(xì)胞結(jié)合特異性的評估

CE4-1與CD20陽性細(xì)胞Raji(圖4A)和Ramos(圖4B)的結(jié)合較強(qiáng)，遠(yuǎn)高于隨機(jī)DNA與兩種細(xì)胞的結(jié)合。而CE4-1與CD20陰性細(xì)胞的結(jié)合與隨機(jī)DNA相似，明顯弱于與CD20陽性細(xì)胞的結(jié)合(圖4C)。

2.4胞膜外CD20蛋白對適配體CE4-1結(jié)合的影響

適配體CE4-1與經(jīng)過胰蛋白酶處理的CD20陽性細(xì)胞的結(jié)合,明顯低于其與未經(jīng)處理同種細(xì)胞的結(jié)合(圖5)。

Flow cytometry profiles of CE4-1’s binding to untreated Raji cells (black curve), and Raji cells treated with trypsin for 10 min (grey curve)； the filled histogram represents the control fluorescent signals generated by FITC-labeled random DNA from the library pool圖5 胞膜外CD20蛋白對適配體CE4-1與細(xì)胞結(jié)合的影響Fig 5 The influence generated by CD20 protein in the binding between aptamer CE4-1 and cells

3 討論

CD20是治療NHL的理想靶點(diǎn)之一[4-9]；與傳統(tǒng)化療相比，CD20單克隆抗體靶向藥物美羅華可改善NHL的治療效果。然而，臨床治療中發(fā)現(xiàn)一部分病人對美羅華不敏感，且很多患者會產(chǎn)生耐藥性[10]，所以目前亟需研發(fā)新型的CD20靶向治療。核酸適配體在腫瘤的靶向治療方面擁有良好的應(yīng)用前景[8-11]，但迄今為止文獻(xiàn)中尚未見關(guān)于CD20適配體的報(bào)道。本研究進(jìn)行了CD20適配體的篩選，隨著SELEX篩選圈數(shù)的推進(jìn)，成功富集到能夠結(jié)合靶標(biāo)CD20多肽的核酸適配體。經(jīng)克隆測序后，從富集庫中獲得了一種能結(jié)合CD20靶標(biāo)的適配體CE4-1。CE4-1能結(jié)合CD20結(jié)構(gòu)，但與BSA的結(jié)合很弱，表明該適配體與CD20的結(jié)合具有一定的特異性。同時(shí)，CE4-1與CD20陽性淋巴瘤細(xì)胞Raji和Ramos有較強(qiáng)結(jié)合，而與CD20陰性細(xì)胞的結(jié)合較弱，表明CE4-1能特異性地識別CD20陽性淋巴瘤細(xì)胞。然而，如將CD20陽性細(xì)胞用胰酶處理，CE4-1與細(xì)胞的結(jié)合明顯減弱，說明該適配體與細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)是胞膜蛋白。

上述結(jié)果顯示，除抗體以外，適配體也可用于識別CD20。本研究研發(fā)的適配體CE4-1能夠結(jié)合CD20陽性的淋巴瘤細(xì)胞，如將CE4-1連接于載藥脂質(zhì)體或納米顆粒，則有可能構(gòu)建出針對NHL的新型靶向治療系統(tǒng)。未來研究可注重于改進(jìn)該適配體的性能，使之在NHL的靶向診療方面具有更好的應(yīng)用潛能。

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Selection and identification of a novel DNA aptamer against CD20 molecule

ZHANG Li-yu1, HU Yan1, CAO Bei-bei1, DUAN Jin-hong1, LIU Zhe2, YANG Xian-da1*

(1.Dept. of Physiology and Pathophsiology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS amp; PUMC, Beijing 100005;2.Laboratory of Clinical Genetics, Peking Union Medical College Hospital, CAMS amp; PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo develop a CD20 aptamer that may potentially serve as a tumor-homing ligand for targeted therapy against non-Hodgkin’s lymphoma (NHL).MethodsA single-stranded 59nt DNA library containing 21 nt random oligonucleotides was synthesized. A new CD20 aptamer termed CE4-1 was developed with SELEX technique, using a CD20 epitope as the target. Flow cytometry was performed to monitor the enrichment of the selected DNA pool, and the binding properties of CE4-1 towards CD20 structure and CD20-positive cells. The structure of CE4-1 was predicted by MFold software.ResultsThe DNA aptamer CE4-1 could selectively bind with CD20 structure and CD20-positive cells, with minimal cross reactivity to BSA and CD20-negative cells. Additionally, trypsin treatment greatly reduced the binding of CE4-1 to CD20-positive cells.ConclusionsA novel CD20 aptamer CE4-1 may recognize CD20 structure and CD20-positive cells selectively, which may have application potentials in targeted therapy against the CD20-positive tumors.

aptamer; SELEX; CD20

2013-12-26

2014-03-12

科技部重大科學(xué)計(jì)劃(2011CB933504)

*通信作者(correspondingauthor)：ayangmd@gmail.com

1001-6325(2014)05-0628-05

R 733.7

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