曹峰琦，陳 翀，劉 妍，白麗鵬，羅云萍

(中國醫(yī)學科學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎(chǔ)學院 免疫學系，北京 100005)

研究論文

腫瘤pH微環(huán)境通過激活β-catenin/TCF4增強人乳腺癌腫瘤細胞的干性

曹峰琦，陳 翀，劉 妍，白麗鵬，羅云萍*

(中國醫(yī)學科學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎(chǔ)學院 免疫學系，北京 100005)

目的探討酸性微環(huán)境對于乳腺癌腫瘤干細胞干性的影響及其作用機制。方法分別在pH 6.8和7.4的環(huán)境下，培養(yǎng)人乳腺癌細胞MDA-MB-231。用流式細胞術(shù)、PCR、Western blot、體外成球?qū)嶒灪图毎麆澓蹖嶒灧謩e檢測腫瘤干細胞ALDHhigh細胞亞群的比率，干性基因SOX2、OCT4和Lin28b的表達，成球能力和腫瘤細胞遷移能力，同時檢測相關(guān)信號通路的激活。結(jié)果酸性微環(huán)境通過激活β-catenin/TCF4信號通路提高MDA-MB-231的ALDHhigh細胞亞群的比例(Plt;0.05)，上調(diào)干性相關(guān)基因的表達(Plt;0.01)，增強體外成球能力(Plt;0.01)和遷移能力(Plt;0.05)。結(jié)論酸性微環(huán)境能夠上調(diào)干細胞比例，維持腫瘤干細胞干性特征，增加乳腺癌腫瘤細胞遷移能力。

乳腺癌；腫瘤干細胞；酸性微環(huán)境

腫瘤干細胞是一群具有高抗放化療特性，能自我更新，自我修復，具有多向分化潛能，能夠在體外形成克隆的一群比例極小的細胞亞群，目前認為是造成腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的根源之一[1-3]。近幾年在多種惡性腫瘤組織中都成功的分離出了腫瘤干細胞，為腫瘤干細胞學說提供了充分的證據(jù)支持[4-6]。雖然腫瘤干細胞在腫瘤組織中所占的比例極少，但他們獨特的干細胞表型是腫瘤逃逸常規(guī)的放化療，導致復發(fā)轉(zhuǎn)移的主要原因[7-8]。

腫瘤干細胞干性的維持需要其所處的微環(huán)境的支持。大量的研究證實，惡性腫瘤組織周圍的pH值在6.8～6.0之間，甚至更低達5.8。而正常組織周圍的pH值一般穩(wěn)定保持在7.35～7.45之間[9-11]。長期以來人們認為酸性微環(huán)境是低氧造成的，而忽略了腫瘤細胞獨特的代謝型--瓦伯格效應，即腫瘤細胞無論是有氧還是低氧環(huán)境下都進行糖酵解反應，從而產(chǎn)生大量的乳酸和氫離子外排，進而形成了酸性微環(huán)境。

已有的研究主要都放在了低氧微環(huán)境對于腫瘤干細胞干性的維持方面，鮮有文獻報道酸性微環(huán)境對于腫瘤干細胞干性的影響，本研究主要探討酸性微環(huán)境對于乳腺癌腫瘤干細胞的作用，并進一步探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞資源中心)。細胞培養(yǎng)基DMEM、胎牛血清、細胞培養(yǎng)用雙抗、100×青霉素-鏈霉素溶液、100×非必需氨基酸(NEAA)和HEPES緩沖液(GIBCO公司)； MES緩沖液(Sigma公司)。ALDH檢測試劑盒(StemCell公司)。兔抗人OCT4，SOX2，Nanog，Lin28b，β-catenin及TCF4抗體(Cell Signaling Technology公司)。鼠抗人HIF1α抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與處理

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%雙抗(青鏈霉素溶液)和1%非必需氨基酸(NEAA)的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2，細胞匯合至80%～90%后用胰蛋白酶消化傳代。分別利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液和2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)液pH為7.4或6.8。分別在pH為7.4和6.8的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)細胞。

1.3 方法

1.3.1 流式細胞術(shù)檢測ALDHhigh細胞群比例： 將2 mL MDA-MB-231人乳腺癌細胞以5×105個/mL接種于6孔板中，分為兩組，每組3孔，分別為pH值為7.4的對照組和pH值為6.8的實驗組。培養(yǎng)12和24 h后，消化收集細胞，300×g離心5 min，PBS漂洗3次，吹打成單細胞懸液，并進行計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為5×105個/mL，重懸于ALDH 測定緩沖液，并按照ALDH檢測試劑盒說明書檢測ALDHhigh細胞群比例。

1.3.2 PCR檢測相關(guān)基因表達： 將2 mL MDA-MB-231人乳腺癌細胞以5×105個/mL接種于6孔板中，分為兩組，每組3孔，分別為pH值為7.4的對照組和pH值為6.8的實驗組。培養(yǎng)12 h后，按常規(guī)Trizol法提取細胞總RNA,進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。應用特定基因引物進行RT-PCR和real-time PCR反應。

1.3.3 Western blot檢測相關(guān)基因表達： MDA-MB-231人乳腺癌細胞分別在pH值7.4和pH值6.8的環(huán)境下培養(yǎng)12 h，PBS漂洗3次，提取細胞總蛋白。傳統(tǒng)Western blot方法進行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，敷抗體，顯影。

1.3.4 體外成球?qū)嶒灒?新鮮配制成球培養(yǎng)基即DMEM/F12無血清培養(yǎng)基內(nèi)添加2%的B27、20 ng/mL的表皮生長因子(EGF)、20 ng/mL的成纖維細胞生長因子(FGF)和1%的雙抗。分別利用4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液和2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液調(diào)節(jié)細胞培養(yǎng)液pH為7.4或6.8。以5 000個/孔接種MDA-MB-231人乳腺癌細胞于6孔板，5 d后統(tǒng)計成球量，計算其成球能力。

1.3.5 細胞劃痕實驗： 6孔板接種MDA-MB-231人乳腺癌細胞，待細胞完全布滿孔底部，進行劃痕實驗。用黃槍頭在每個孔中平直劃一道線，然后將孔中培養(yǎng)基換成經(jīng)4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液和2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)緩沖液調(diào)節(jié)pH為7.4或6.8的含1%胎牛血清的培養(yǎng)基；每道劃痕選取3個獨立視野拍照，分別記錄0 和24 h后鏡下劃痕的寬度，然后根據(jù)平均值計算每道劃痕的寬度。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1酸性微環(huán)境增加人乳腺癌細胞系MDA-MB-231腫瘤干細胞ALDHhigh細胞群比例

人乳腺癌細胞系MDA-MB-231在pH為6.8的微環(huán)境下培養(yǎng)12 h，其腫瘤干細胞ALDHhigh細胞亞群比率(21.7%±0.07%)相比于在pH為7.4的微環(huán)境下培養(yǎng)者(5.88%±0.23%)，有顯著的增高(Plt;0.01)(圖1A)。分別在pH為6.8的微環(huán)境下(12.40%±0.85%)和pH為7.4的微環(huán)境下(5.07%±0.56%)培養(yǎng)24 h，酸性微環(huán)境下其腫瘤干細胞ALDHhigh細胞亞群比率也同樣有明顯的增高(Plt;0.05)(圖1B)。

A.treated by 12 hours; B.treated by 24 hours; *Plt;0.05, **Plt;0.01 compared with pH 7.4 control group圖1 MDA-MB-231細胞在不同pH微環(huán)境下培養(yǎng)腫瘤干細胞ALDHhigh細胞群比例

2.2酸性微環(huán)境上調(diào)人乳腺癌細胞系MDA-MB-231干性基因的表達

與在pH為7.4的微環(huán)境下培養(yǎng)相比，酸性微環(huán)境可以顯著上調(diào)MDA-MB-231細胞OCT4、SOX2和Lin28b等干性基因RNA水平(圖2A，B)和蛋白質(zhì)水平(圖2C)的表達。

2.3酸性微環(huán)境提高人乳腺癌細胞系MDA-MB-231體外成球能力

在pH為7.4的微環(huán)境下， MDA-MB-231細胞體外成球能力為8.57%±0.12%。而在pH為6.8的微環(huán)境下，MDA-MB-231細胞體外成球能力顯著提高至12.47%±0.18%(Plt;0.01)(圖3)。

2.4酸性微環(huán)境增強人乳腺癌細胞系MDA-MB-231的遷移能力

在pH為7.4的微環(huán)境下， MDA-MB-231細胞的24 h遷移率為0.07%±0.02%。而在pH為6.8的微環(huán)境下，MDA-MB-231細胞的24 h遷移率顯著增強，達到0.17%±0.03%(Plt;0.05)(圖4)。

A.RT-PCR; B.real-time PCR; C.Western blot; *Plt;0.01, **Plt;0.001 compared with pH 7.4 control group圖2 不同pH微環(huán)境下MDA-MB-231細胞干性基因的表達結(jié)果Fig 2 The expression of stemness genes in MDA-MB-231 cells cultured with different pH conditional medium

A.sphere test(×100); B.quantitative results; *Plt;0.01 compared with pH 7.4 control group圖3 不同pH微環(huán)境下MDA-MB-231細胞體外成球功能Fig 3 Sphere formation of MDA-MB-231 cells cultured with different pH conditional medium(×100)

2.5酸性微環(huán)境可以激活β-catenin/TCF4信號通路

與正常微環(huán)境相比，酸性微環(huán)境下β-catenin/TCF4信號通路的活化程度更高，而且轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的表達也有明顯上調(diào)(圖5)。

3 討論

腫瘤干細胞理論對于腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了堅實的理論基礎(chǔ)，大量的研究已經(jīng)明確了炎性微環(huán)境[12-13]，低氧微環(huán)境等對于腫瘤干細胞的作用，而酸性微環(huán)境與腫瘤干細胞的關(guān)系卻鮮有報道，本研究通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH來模擬微環(huán)境的酸性程度，以pH 6.8模擬腫瘤酸性微環(huán)境，pH 7.4模擬正常微環(huán)境[14]。分別在酸性微環(huán)境和正常微環(huán)境下培養(yǎng)人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，探究酸性微環(huán)境對腫瘤干細胞的作用。

A.mobility test(×40); B.quantitative results; *Plt;0.05 compared with pH 7.4 control group圖4 不同pH微環(huán)境下MDA-MB-231細胞遷移能力Fig 4 The mobility of MDA-MB-231 cells cultured with different pH conditional medium(×40)

A.Western blot; B.RNA level of TCF4; *Plt;0.05 compared with pH 7.4 control group圖5 酸性微環(huán)境激活β-catenin/TCF4信號通路Fig 5 The activation of β-catenin/TCF4 signaling pathway by the acidic microenvironment

腫瘤干細胞研究的難點在于腫瘤干細胞所占的比例微乎其微，而且對于腫瘤干細胞的鑒定也沒有一個普遍適用的標準，并沒有一種能夠適用于所有腫瘤細胞的篩選標志物，造成腫瘤干細胞的分選鑒定的困難，從而制約了對其的深入研究。本研究以ALDHhigh作為腫瘤干細胞的篩選標志物。

本研究結(jié)果顯示，酸性微環(huán)境下，人乳腺癌細胞系MDA-MB-231的腫瘤干細胞比例有顯著地增多，而在pH 6.8條件下培養(yǎng)24h ALDHhigh細胞亞群比率相比于12 h有明顯下降，主要原因可能是非腫瘤干細胞的大量凋亡，造成腫瘤細胞群基數(shù)的增大；并且RNA水平和蛋白質(zhì)水平的結(jié)果顯示在酸性微環(huán)境下，干性相關(guān)基因的表達，如OCT4、SOX2和Lin28b都有明顯的上調(diào)。Lin28b作為一個保守的RNA結(jié)合蛋白，與干性的調(diào)節(jié)與代謝都有一定的關(guān)聯(lián)，可能在酸性微環(huán)境中干性調(diào)節(jié)中起著重要的作用，有待于進一步探討。體外成球?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，酸性微環(huán)境能夠促進體外成球。同時，腫瘤的遷移能力也被認為與腫瘤干細胞相關(guān)，結(jié)果顯示，酸性微環(huán)境也可以顯著增強人乳腺癌細胞系MDA-MB-231的遷移能力。所有的結(jié)果均提示，酸性微環(huán)境有利于提高腫瘤干細胞比例，顯著上調(diào)干性相關(guān)基因的表達，維持腫瘤細胞干性。

而對于酸性微環(huán)境對于干性的調(diào)節(jié)機制，本研究結(jié)果顯示，酸性微環(huán)境可以激活β-catenin/TCF4信號通路以及上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子HIF1α的表達，提示酸性微環(huán)境可以通過激活β-catenin/TCF4信號通路，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子HIF1α，從而實現(xiàn)對干性的調(diào)控。

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The tumor pH microenvironment enhance stemnessproperties via β-catenin/TCF4 activation in human breast cancer cells

CAO Feng-qi, CHEN Chong, LIU Yan, BAI Li-peng, LUO Yun-ping*

(Institute of Basic Medical Sciences, CAMS，School of Basic Medicine, PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo investigate the effects of acidic tumor microenvironment on maintaining stemness and underneath mechanism in breast cancer stem cells.MethodsHuman breast cancer cell MDA-MB-231 with either pH 6.8 or pH 7.4 medium, the percentage of ALDHhighsubpopulation, the expression of SOX2, OCT4, Lin28b and the stemness properties were detected by using FCM, Real-time PCR, Western blot, sphere test and scratch experiments. The activation of signaling pathway was also examined.ResultsAll stemness properties of MDA-MB-231 cell cultured with pH 6.8 conditional medium were increased including the percentage of ALDHhighsubpopulation(Plt;0.05), the expression of stemness gene(Plt;0.01), the capability of sphere formation(Plt;0.01) and cell mobility(Plt;0.05). These stemness properties of MDA-MB-231 cell were regulated via β-catenin/TCF4 signaling pathway that activated by pH 6.8 cultured medium.ConclusionsThe acidic tumor microenvironment increases the percentage of ALDHhighsubpopulation and enhances stemness phenotypes of breast cancer cells.

breast cancer; cancer stem cells; acidic microenvironment

2014-02-17

2014-03-12

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(2013CB967202)

*通信作者(correspondingauthor)：yunpingluo@hotmail.com

1001-6325(2014)05-0622-06

R 73-35+4

A