孫 洋，張婷婷，王翠萍，陳 杰*，趙 紅

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 1.國家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室 病理科;2.北京協(xié)和醫(yī)院 病理科；3.北京積水潭醫(yī)院 病理科, 北京 100730)

hsa-mir-615過表達(dá)胰腺癌穩(wěn)定細(xì)胞亞系的構(gòu)建及功能初步驗證

孫 洋1,2，張婷婷2,3，王翠萍2，陳 杰2*，趙 紅1

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 1.國家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室 病理科;2.北京協(xié)和醫(yī)院 病理科；3.北京積水潭醫(yī)院 病理科, 北京 100730)

慢病毒(Lentivirus)載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)[1]。本實驗在對胰腺癌差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)hsa-mir-615在胰腺癌組織和胰腺正常導(dǎo)管上皮組織中呈現(xiàn)差異表達(dá)[2]，異常表達(dá)的microRNA可能具有生物學(xué)功能。因此，本實驗構(gòu)建hsa-mir-615過表達(dá)慢病毒載體并包裝成慢病毒，感染人胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2，建立hsa-mir-615過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系，使用CCK-8法觀察hsa-mir-615對胰腺癌細(xì)胞系生長的影響，為進(jìn)一步研究hsa-mir-615的生物功能構(gòu)建細(xì)胞模型。

1材料與方法

1.1 細(xì)胞系及包裝病毒：胰腺癌細(xì)胞系MIA PaCa-2(American type culture collection，ATCC)。慢病毒包裝細(xì)胞系為人類胚腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院分子病理實驗室保存)。慢病毒包裝采用羅氏LV系統(tǒng)(Tronolab公司)，由pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G、Lenti-GFP-RNAi四質(zhì)粒系統(tǒng)組成。

1.2 主要試劑及引物：RNA提取、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA、qPCR及hsa-mir-615表達(dá)檢測試劑盒(曠博公司)(Cat.0960602， Cat. 0960401，Cat. 0960211及Cat.0960302)。內(nèi)切酶及連接酶(NEB公司產(chǎn)品)。轉(zhuǎn)染使用羅氏FuGENE? HD轉(zhuǎn)染試劑。

根據(jù)genbank及mirbase數(shù)據(jù)庫[3]獲取基因hsa-mir-615(Gene ID: 693200)序列，設(shè)計擴(kuò)增引物：mir-615-F:5′-CTGT GTGCGCCCAAATTTACGACG-3′，mir-615-R:5′-CGGAATTC AGGGGTGAATAGCTTGCAGCGTTCC-3′

1.3 hsa-mir-615過表達(dá)慢病毒制備：采用PCR技術(shù)，以含有has-mir-615基因前體的人基因組DNA為模板擴(kuò)增目的基因，連接入Lenti-GFP-RNAi載體后，轉(zhuǎn)化入DH5α培養(yǎng)。PCR及測序鑒定細(xì)菌陽性克隆，擴(kuò)增轉(zhuǎn)化菌后提取含有mir-615DNA的Lenti-GFP-RNAi質(zhì)粒, 按照說明書在293T細(xì)胞中制備慢病毒。

1.4 miR-615過表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)系建立及驗證：將靶細(xì)胞分為未處理組(MIA PaCa-2)、mock組(MIA PaCa-2-pLTUGW-Mock)和mir-615組(MIA PaCa-2-pLTUGW-615)，分別感染PBS、空載病毒及含有mir-615DNA的病毒。感染48 h后，觀察靶細(xì)胞熒光表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測感染效率，RT-qPCR法檢測miR-615表達(dá)情況。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞活率：將未處理的MIA PaCa-2，Miapaca-2-pLTUGW-615和Miapaca-2-pLTUGW-Mock細(xì)胞均以3 000個細(xì)胞/孔接種于96孔板，于接種后24、48、72、96和120 h時更換為含10% CCK-8的培養(yǎng)基，37 ℃、 5% CO2的條件下培養(yǎng)1.5 h，檢測波長為A450時的吸光度值。

2結(jié)果

2.1 hsa-mir-615過表達(dá)胰腺癌穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建:hsa-mir-615DNA擴(kuò)增(圖1)、酶切、重組載體PCR鑒定，PCR產(chǎn)物帶與預(yù)期目的分子大小一致。病毒感染MIA PaCa-2細(xì)胞48 h后，流式測定感染效率接近或超過90%。與對照細(xì)胞相比， MIA PaCa 2-pLUGW-mir-615 中mir-615過表達(dá)(圖2)。由于慢病毒能夠整合到細(xì)胞的基因組中，從而可以穩(wěn)定地表達(dá)目的基因，據(jù)此構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系。

2.2 mir-615功能初步驗證:用CCK-8法檢測miR-615對胰腺癌細(xì)胞的生長情況的影響，相對于mock組， mir-615組從72 h開始即能夠顯著抑制MIA PaCa-2(圖3)細(xì)胞的生長；與mock組相比， 72、 96、120 h抑制率分別為23.79%、 26.55%和38.67%(均Plt;0.05)。

1～3.hsa-mir-615; M.marker圖1 hsa-mir-615擴(kuò)增 Fig 1 Amplification of hsa-mir-615

*Plt;0.05 compared with MIA PaCa 2-pLUGW-miR-615圖2 RT-qPCR鑒定mir-615過表達(dá)Fig 2 RNA expression of miR-615was assessedby RT-qPCR

3討論

hsa-mir-615位于人類染色體12q13.13，存在于胚胎發(fā)育過程中重要轉(zhuǎn)錄因子HOX基因組群集區(qū)內(nèi)。作為一個新發(fā)現(xiàn)的microRNA分子，關(guān)于miR-615的研究還比較少，本研究已經(jīng)證實在胰腺癌組織中存在miR-615的成熟體miR-615-5p的低表達(dá)，并且使用瞬時轉(zhuǎn)染的方法在體外研究發(fā)現(xiàn)miR-615的兩個成熟體miR-615-5p和miR-615-3p對胰腺癌細(xì)胞均具有生長抑制作用。由于瞬時轉(zhuǎn)染人工合成的 miRNA mimics在細(xì)胞內(nèi)很容易被降解，不能實現(xiàn)穩(wěn)定的miRNA 表達(dá)。為了能夠長期穩(wěn)定觀察miR-615的功能，本實驗使用慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)miR-615的胰腺癌細(xì)胞系。為下一步的功能實驗提供穩(wěn)定過表達(dá)miR-615的模型。

*Plt;0.05,**Plt;0.01 compared with MIA Pala2-pLUGW-mir-615圖3 未處理的Miapaca-2細(xì)胞Miapaca-2-pLTUGW-615細(xì)胞和Miapaca-2-pLTUGW-Mock細(xì)胞的生長曲線Fig 3 Cell survival analysis of MIA PaCa-2 cellsoverexpressing miR-615

為了研究miR-615基因的功能，使用CCK-8實驗初步檢驗了miR-615組和mock組細(xì)胞的增殖情況，在相同數(shù)目鋪板的情況下，本研究建立的miR-615穩(wěn)定過表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞的生長速度比mock組慢，自72 h起即具有統(tǒng)計學(xué)意義,這個結(jié)果與瞬時轉(zhuǎn)染miR-615 mimic時對胰腺癌細(xì)胞的生長功能相一致。

本研究首次構(gòu)建miR-615過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系，為miR-615用于胰腺癌的基因治療邁出重要一步，為后續(xù)實驗和臨床治療奠定了基礎(chǔ)。

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2013- 12- 12

2014- 03- 25

國家自然科學(xué)基金 (30973470, 81172334)；國家科技支撐計劃(十一五)項目 (2006BAI02A14)；衛(wèi)生部衛(wèi)生行業(yè)科研專項項目(200802011)

*通信作者(correspondingauthor)：xhblk@163.com

1001-6325(2014)10-1414-02

R 735.9

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