李 熠，匡雙玉，尹 凱，匡穩(wěn)定，桂慶軍*

(南華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.診斷學(xué)教研室；2.附屬第二醫(yī)院， 湖南 衡陽 421001)

研究論文

脂聯(lián)素減輕高糖誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細胞系損傷

李 熠1，匡雙玉2，尹 凱1，匡穩(wěn)定2，桂慶軍1*

(南華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.診斷學(xué)教研室；2.附屬第二醫(yī)院， 湖南 衡陽 421001)

目的觀察脂聯(lián)素(APN)對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞系損傷的保護作用及NF-κB與LOX- 1蛋白表達在其中的作用。方法30 mmol/LD-葡萄糖作用于HUVEC- 12(人臍靜脈內(nèi)皮細胞系)，不同濃度的脂聯(lián)素(10、20和40 μg/mL)作用48 h及20 μg/mL 脂聯(lián)素作用不同時間(12、24、48和72 h)后，倒置相差顯微鏡觀察內(nèi)皮細胞形態(tài)，Western blot檢測核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和LOX- 1蛋白表達, 間接免疫熒光法檢測NF-κB核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果脂聯(lián)素作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12，內(nèi)皮細胞形態(tài)改善，折光性增強，胞內(nèi)顆粒物減少，細胞排列相對規(guī)整；同時，LOX- 1蛋白表達下調(diào)(Plt;0.05)，NF-κB活性降低(Plt;0.05)，并呈現(xiàn)時間和濃度依賴性(n=3,Plt;0.05)。結(jié)論脂聯(lián)素可能通過NF-κB信號通路引起LOX- 1蛋白表達下調(diào)，從而發(fā)揮其對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用。

D-葡萄糖；人臍靜脈內(nèi)皮細胞；脂聯(lián)素；LOX- 1；NF-κB

脂聯(lián)素(Adiponectin，APN)是一種由脂肪細胞分泌的血漿蛋白，通過抑制炎性反應(yīng)、保護血管內(nèi)皮、抗動脈粥樣硬化及抑制血管新生等[1- 5]發(fā)揮其心血管保護作用，但具體機制尚不清楚。本實驗在高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞系損傷的模型上，觀察APN對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的保護作用及NF-κB、LOX- 1蛋白表達在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

脂聯(lián)素(Ramp;D公司)；RMPI- 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶(Hyelone公司)；新生胎牛血清(杭州四季清公司)；BCA 蛋白定量試劑盒和Western印跡熒光檢測試劑盒(Hyclone. Pierce公司)；LOX- 1和NF-κB一抗(Santa Cruz公司)；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC-12)的培養(yǎng)

HUVEC- 12(ATCC公司)。HUVEC- 12培養(yǎng)在10%(體積分數(shù))加熱滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中加青霉素和鏈霉素各1.0×105IU/L，培養(yǎng)條件為5%(體積分數(shù))CO2，37 ℃，飽和濕度，0.125%的胰蛋白酶傳代,待細胞長至70%～80%匯合的時候進行試驗。倒置相差顯微鏡下觀察，細胞為鵝卵石樣。

1.3 HUVEC- 12的形態(tài)學(xué)觀察

使用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)和生長情況。

1.4Westernblot檢測HUVEC-12中NF-κB和LOX-1蛋白質(zhì)的表達水平

收集不同條件處理的HUVEC- 12細胞，三去污裂解液裂解細胞，5 000 r/min離心去除沉淀，BCA試劑測定蛋白含量，上樣緩沖液調(diào)各組蛋白濃度使各組一致，經(jīng)10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳2 h(積層膠80 V，分離膠120 V)后電轉(zhuǎn)移(4 ℃，100 mA，3 h)至PDVF膜上，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果，并確定蛋白分子質(zhì)量標準的位置。用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h，按1∶1 000加入兔抗鼠SREBP- 1一抗，37 ℃孵育2 h，TBST洗3次，1∶2 000加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗，37 ℃孵育0.5 h，TBST洗3次后，用Western blot熒光檢測試劑盒顯影、定影。結(jié)果重復(fù)3次。用圖象分析儀分析目的蛋白/內(nèi)參照吸光度比值。

1.5間接免疫熒光檢測HUVEC-12細胞NF-κB核轉(zhuǎn)位

取對數(shù)生長期細胞，以4×104/孔接種于24孔培養(yǎng)板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜后，按分組要求給以不同處理因素。處理終結(jié)，用預(yù)冷的PBS洗滌3次，每孔加固定液(甲醇∶冰乙酸 3∶1)200 μL，在4 ℃條件下固定15 min，再用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加穿透液(0.25%聚乙二醇辛基苯基醚+5%二甲基亞砜混合液)1 mL，37 ℃放置45 min，再用預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入一抗(1∶200)200 μL，37 ℃孵育1 h，預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入羅丹明和綠色熒光(FITC)標記的二抗(1∶10)50 μL，37 ℃孵育1 h，熒光倒置顯微鏡下觀察并照相。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC- 12的形態(tài)學(xué)變化

不同濃度的D-葡萄糖(15、30和60 mmol/L)作用于HUVEC- 12 48 h及30 mmol/L D-葡萄糖作用于HUVEC- 12不同時間(12、24、48及72 h)后，對照組內(nèi)皮細胞生長狀態(tài)良好，細胞之間緊密連接，呈多角形或扁平形，折光性強，而不同劑量和不同作用時間的高糖誘導(dǎo)組的HUVEC- 12折光性變?nèi)?，排列較為紊亂，細胞系模糊，細胞間隙明顯增大，細胞內(nèi)顆粒狀物增多。以30 mmol/LD-葡萄糖作用于HUVEC- 12 48 h的內(nèi)皮細胞形態(tài)變化最明顯(圖1)。

2.2APN干預(yù)下的D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12細胞形態(tài)學(xué)變化

不同濃度APN(10、20和40 μg/mL)作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12 48 h及20 μg/mL APN作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12不同時間(12、24、48 和72 h)后，與對照組相比，誘導(dǎo)組內(nèi)皮細胞收縮，變圓，胞體變小，胞內(nèi)顆粒明顯增多，而APN干預(yù)組相比誘導(dǎo)組其內(nèi)皮細胞形態(tài)改善較明顯，折光性增強，胞內(nèi)顆粒減少。排列相對規(guī)整。以20 μg/mL APN作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12 48 h形態(tài)變化最顯著(圖2)。

A.control; B.model圖1 D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC- 12細胞形態(tài)改變Fig 1 The morphology changes of HUVEC- 12 cells induced by D-glucose(×400)

A.control; B.model; C.APN圖2 APN干預(yù)下的D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12形態(tài)改變Fig 2 The morphology changes of D-glucose induced HUVEC- 12 by APN(×400)

2.3APN對D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12中NF-κB及LOX-1蛋白表達的影響

不同濃度APN(10、20及40 μg/mL)作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12 48 h后，NF-κB及LOX- 1蛋白表達下調(diào)，其中20 μg/mL APN使NF-κB及LOX- 1蛋白表達下調(diào)最明顯 (圖3)。

2.4APN干預(yù)下D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC-12中NF-κB及LOX-1蛋白表達的時效變化

20 μg/mL APN作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12不同時間(12、24、48和72 h)后，在APN不同時間的干預(yù)下，D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12中NF-κB及LOX- 1蛋白表達均下調(diào)，其中作用48 h后的內(nèi)皮細胞NF-κB及LOX- 1蛋白表達下調(diào)最明顯(圖4)。

2.5APN對D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC-12中NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響

20 μg/mL脂聯(lián)素作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12 48 h后，正常對照組內(nèi)皮細胞組中， P65綠色熒光信號信號主要定位于胞質(zhì)，胞核少見或未見(圖5)。

1.model；2.10 μg/mL；3.20 μg/mL；4.40 μg/mL; *Plt;0.05 compared with model group圖3 APN干預(yù)下D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC- 12細胞中LOX- 1蛋白表達量效關(guān)系Fig 3 LOX- 1 protein expression with a dose-dependant manner in D-glucose induced HUVEC- 12 by APN(n=3)

1.model; 2.12 hours; 3.24 hours; 4.48 hours; 5.72 hours; *Plt;0.05 compared with model group圖4 APN干預(yù)下D-葡萄糖誘導(dǎo)HUVEC- 12中LOX- 1蛋白表達時效關(guān)系Fig 4 LOX- 1 protein expression with a time-dependant manner in D-glucose induced HUVEC- 12 by APN(n=3)

A.control; B.model; C.APN圖5 不同作用下的HUVEC- 12中 NF-кB-P65蛋白的核轉(zhuǎn)位熒光圖Fig 5 Different fluorescent nuclear translocation of NF-кB-P65 in HUVEC-12 cells(×400)

3 討論

APN是由脂肪細胞特異性分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽或蛋白質(zhì), 目前認為其是一種胰島素抵抗和動脈粥樣硬化的保護因子[6- 7]。本實驗通過不同濃度脂聯(lián)素作用于D-葡萄糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12不同時間，觀察內(nèi)皮細胞形態(tài)及檢測細胞內(nèi)LOX- 1表達。發(fā)現(xiàn)隨APN濃度的增加和作用時間的延長，HUVEC- 12中LOX- 1蛋白表達均下調(diào)，受損細胞形態(tài)得到了一定程度的改善；證實了APN可以通過下調(diào)高糖誘導(dǎo)的HUVEC- 12中LOX- 1的表達，從而發(fā)揮其保護血管內(nèi)皮的功能。

文獻報道，LOX- 1在介導(dǎo)內(nèi)皮損傷中發(fā)揮重要作用[8]。調(diào)控LOX- 1蛋白表達的機制眾多，炎性因子，氧化應(yīng)激產(chǎn)物以及機械刺激等可誘導(dǎo)其表達。大鼠LOX- 1基因啟動子區(qū)域含有多個順式作用元件，如NF-κB，表明LOX- 1的表達可能受NF-κB激活的調(diào)控[9]。本實驗發(fā)現(xiàn)不同濃度的APN作用高糖誘導(dǎo)組內(nèi)HUVEC- 12不同時間，在受損的內(nèi)皮細胞內(nèi)NF-κB-P65表達下調(diào)的同時，其對應(yīng)的內(nèi)皮細胞內(nèi)LOX- 1表達水平也下調(diào)，表明LOX- 1蛋白的表達下調(diào)與APN作用于受損內(nèi)皮細胞引起的NF-κB蛋白表達水平下調(diào)存在一定關(guān)系。

為了進一步說明APN可以通過NF-κB途徑調(diào)控LOX- 1表達，本實驗用免疫熒光觀察使用了APN后，APN可抑制受損內(nèi)皮細胞內(nèi)的NF-κB向胞核內(nèi)遷移，阻礙其啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄，減少LOX- 1蛋白的表達。其機制可能與APN與細胞系內(nèi)特定的靶基因結(jié)合，啟動了IκB等抑制亞單位的表達或者抑制了IκB的快速磷酸化和降解，減少了NF-κB活化[10]。

本實驗以體外培養(yǎng)的HUVEC- 12為研究對象，觀察了APN對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用，同時研究了在此過程中細胞內(nèi)NF-κB與LOX- 1蛋白的表達，為進一步闡明糖尿病動脈粥樣硬化早期的發(fā)病機制提供了一定的實驗依據(jù)。

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Adiponectin alleviates hyperglycemia induced vascular endothelial cells injury

LI Yi1, KUANG Shuang-yu2, YIN Kai1, KUANG Wen-ding2, GUI Qing-jun1*

(1.Medical College, University of South China; 2.the Second Affiliated Hospital,University of South China， Hengyang 421001， China)

ObjectiveTo observe the protective effect of adiponectin (APN) on hyperglycemia-induced vascular endothelial cell injury,and to investigate the expresstion of NF-κB and LOX- 1 in the role of the protection process.MethodsD-Glucose of 30 mmol/L effect on HUVEC- 12 for 48 hours to create a hyperglicemia-model of injured vascular endothelial cells, Incubate the cells with different concentration adiponectin(10,20,40 μg/mL) for 48 hours and adiponectin of 20 μg/mL for different time(12,24,48,72 h)and then to observe the morphologic changes of the endothelial cells and the expression of NF-κB and LOX- 1 protein in the HUVEC- 12 was detected by Western blot, and NF-κB nuclear translocation in cells was observed by indirect immunofluorescence.ResultsD-Glucose-induced HUVEC- 12 were effected by adiponectin with different density and time, The morphologic changes of the cells converted to ameliorate: the reflected light of the HUVEC- 12 was strengthened, particulate matter in cells was not clear and the cell shape converted from roundness to flat or polygon, NF-κB and LOX- 1 protein expression were down-regulated partly with a dose and time-dependence(n=3,Plt;0.05).ConclusionsAdiponectin (APN) may down-regulate LOX- 1 protein expression through NF-kB signaling pathway so the protective effect on D-Glucose-induced HUVEC- 12.

D-Glucose; HUVEC- 12; Adiponectin; LOX- 1; NF-κB

2013- 03- 25

2014- 04- 18

2013年湖南省教育廳優(yōu)秀青年科研項目(2013B098)

*通信作者(correspondingauthor)：zd81412@163.com

1001-6325(2014)10-1386-05

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