張丹丹，王欣欣

（青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，山東 青島 266042）

鹽酸馬布特羅是一種β2腎上腺受體激動劑，主要用于防治人、畜支氣管哮喘和痙攣［1］，其結(jié)構(gòu)式見圖1.鹽酸馬布特羅分子中含有一個手性中心，具有一對呈鏡像對映關(guān)系的異構(gòu)體，但目前應(yīng)用的鹽酸馬布特羅均為外消旋體.手性化合物的對映體常具有不同的藥理、毒理作用及藥物動力學(xué)特征［2-5］，研究表明，在臨床上有效的一般為其左旋體，而其右旋體則對療效沒有貢獻(xiàn)［6］.因此，對鹽酸馬布特羅對映體進(jìn)行拆分研究，建立簡單、快速、靈敏、分離性能好的測定方法是一個具有理論及實際意義的課題.目前，對該藥物的拆分報道較少，主要有高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法.如郭偉等人用自制3，4-二氯-萬古霉素手性固定相分離了馬布特羅對映體［7］，但分離度只有1.01；韓亞瓊等人在自制替考拉寧手性柱上拆分了馬布特羅對映體［8］，但分離度只有1.51，均未實現(xiàn)基線分離；另有楊晶等人用毛細(xì)管電泳法以多種環(huán)糊精為手性添加劑拆分馬布特羅對映體的報道［9］.本文作者采用三種大環(huán)抗生素類手性固定相Chirobiotic V，T和R（結(jié)構(gòu)式見圖2）對鹽酸馬布特羅對映體直接進(jìn)行了分離，考察了分離模式、流動相組成及柱溫的影響，并研究了對映體的熱力學(xué)行為，探討了手性分離的機(jī)制.

圖1 馬布特羅的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of mabuterol

圖2 三種大環(huán)抗生素類手性固定相的結(jié)構(gòu)式Fig.2 The structures of macrocyclic antibiotic chiral stationary phases

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Jasco UV-980型高壓輸液泵，Jasco UV-975型檢測器（Jasco日本分光公司），IC 2001plus型柱溫箱，Anastar色譜工作站，U6K型進(jìn)樣閥（20μL定量環(huán)），DT-100A型分析天平，PHS-25型pH計，DL-180型超聲波清洗機(jī).

鹽酸馬布特羅由青島雙鯨藥業(yè)提供；甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純（天津市康科德科技有限公司）；冰醋酸、三乙胺、硝酸銨均為特級純（天津市博迪化工有限公司）.

1.2 色譜條件

色譜柱：Chirobiotic V（250×4.6mmI.D.，5m），Chirobiotic T（150×4.6mmI.D.，5m）和Chirobiotic R（250×4.6mmI.D.，5m）色譜柱（Advanced Separation Technologies Inc.，美國）.流動相：甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.01∶0.01，V/V/V）.流速1.0mL/min；紫外檢測波長254nm；進(jìn)樣量20μL.馬布特羅對照品用甲醇溶解，配制成濃度為1.0g/L的供試液.

2 結(jié)果與討論

2.1 新極性有機(jī)相模式下鹽酸馬布特羅對映體的分離

大環(huán)抗生素類手性固定相有正相、反相和新極性有機(jī)相三種分離模式.由于此類固定相的大環(huán)抗生素類結(jié)構(gòu)中具有可離子化基團(tuán)，所以可以將流動相組成轉(zhuǎn)變?yōu)?00%甲醇，添加適量的有機(jī)酸和堿來改善其對對映體的選擇性.當(dāng)被分析物的分子結(jié)構(gòu)中含有一個以上可以與手性固定相的手性位點發(fā)生相互作用的官能團(tuán)時，新極性有機(jī)相模式就可以被使用，而且是首選的分離模式.本文中鹽酸馬布特羅的結(jié)構(gòu)中含有多個可以與手性固定相的手性位點發(fā)生相互作用的官能團(tuán)，如鹵素，羥基，氨基和苯基等，因此新極性有機(jī)相模式被確定為首選的分離模式.

2.1.1 緩沖溶液類型對分離的影響

在新極性有機(jī)相模式下，化合物的保留行為和對映體選擇性主要受有機(jī)酸和有機(jī)堿的濃度和比例的影響.考察了0.1%醋酸銨、0.1%硝酸銨和0.1%醋酸三乙胺三種緩沖系統(tǒng)對分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽酸馬布特羅在0.1%醋酸銨和硝酸銨緩沖系統(tǒng)中完全不能實現(xiàn)分離，且色譜峰拖尾，對稱性較差；而在0.1%醋酸三乙胺緩沖系統(tǒng)中可以得到一定的手性分離，因此在后續(xù)實驗中選用0.1%醋酸三乙胺做為流動相的緩沖系統(tǒng).

2.1.2 緩沖溶液濃度對分離的影響

以甲醇-冰醋酸-三乙胺系統(tǒng)作為流動相，考察了冰醋酸和三乙胺的濃度和比例對分離的影響.在Chirobiotic R手性固定相上，無論如何優(yōu)化條件，鹽酸馬布特羅對映體均不能實現(xiàn)分離.在Chirobiotic V和T手性固定相上，當(dāng)流動相中只含有冰醋酸而不含有三乙胺時，均只能檢測到一個變形的色譜峰，不能實現(xiàn)手性分離；在含有三乙胺的流動相中，鹽酸馬布特羅可實現(xiàn)一定的分離，冰醋酸的加入對化合物的手性識別不起主要作用，但可以改善色譜峰的峰形和對稱性.采用甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.1∶0.1，V/V/V）為起始流動相，考察了緩沖液成分（冰醋酸/三乙胺）的濃度對鹽酸馬布特羅在Chirobiotic V和T手性固定相上保留行為和對映體選擇性的影響.隨著冰醋酸/三乙胺的濃度從0.1%降低至0.02%或0.01%，鹽酸馬布特羅保留時間明顯延長，分離效果顯著提高；但當(dāng)冰醋酸/三乙胺的濃度繼續(xù)降低至0.005%時，保留時間過長，色譜峰展寬，分離效果下降.具體數(shù)據(jù)見表1.由此確定甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.01∶0.01，V/V/V）為最佳流動相，在此條件下，鹽酸馬布特羅在Chirobiotic V和Chirobiotic T手性固定相上均可實現(xiàn)基線分離，分離色譜圖見圖3.

表1 流動相組成對鹽酸馬布特羅對映體保留行為和分離的影響Table 1 Effect of mobile phase compositon on retention，separation factor and resolution factor of mabuterol on Chirobiotic V and T CSPs

圖3 鹽酸馬布特羅對映體在Chirobiotic V和T手性固定相上的分離色譜圖Fig.3 Enantioseparaion chromatograms of mabuterol on Chirobiotic V and T CSPs

2.1.3 柱溫對分離的影響及熱力學(xué)性質(zhì)研究

本文作者研究了柱溫變化對鹽酸馬布特羅在Chirobiotic V和T手性固定相上保留行為和對映體選擇性的影響，以甲醇-冰醋酸-三乙胺（100∶0.01∶0.01，V/V/V）為流動相，考察了在10，20，30和40℃下的分離情況.隨著溫度的降低，鹽酸馬布特羅的保留時間延長，對映體選擇性有所提高，具體數(shù)據(jù)見表2.權(quán)衡分離度，保留時間及實際操作性，選取最佳分離溫度為20℃.

表2 溫度對馬布特羅在替考拉寧手性固定相上分離效果的影響Table 2 The effects of temperature on retention，separation factor and resolution factor of mabuterol on Chirobiotic V and T chiral stationary phases

根據(jù)Van’t Hoff等式，色譜參數(shù)、柱溫和熱力學(xué)參數(shù)的關(guān)系為：lnα＝-ΔH/（RT）＋ΔS/R，式中R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度，ΔH和ΔS分別代表對映體與手性固定相相互作用的焓變差和熵變差.在表2考察的溫度范圍內(nèi)，得到鹽酸馬布特羅在Chirobiotic V手性固定相上的ΔH和ΔS分別為-198.42kJ/mol和-0.38J/mol，在Chirobiotic T手性固定相上的ΔH和ΔS分別為-401.72kJ/mol和-0.95J/mol，數(shù)值均為負(fù)值，表明其手性識別過程均為焓控過程.

2.2 反相模式下鹽酸馬布特羅對映體的分離

大環(huán)抗生素類手性固定相在反相模式下其保留行為和選擇性主要受有機(jī)改性劑的性質(zhì)和濃度，緩沖鹽的性質(zhì)、濃度和pH的影響.本文作者通過優(yōu)化這些分離條件，在Chirobiotic V手性固定相上可使馬布特羅對映體部分分離；但在Chirobiotic T和Chirobiotic R手性固定相上均不能實現(xiàn)分離.

在Chirobiotic V手性固定相上，硝酸銨在多數(shù)情況下已被證明是最佳選擇，為廠家建議使用的緩沖鹽.但在本文中，通過分離效果的比較，三乙胺醋酸緩沖鹽（0.1%TEAA）被證明分離效果更佳.在該固定相所適應(yīng)的pH范圍內(nèi)（4.0～7.0）考察了緩沖鹽pH的變化對分離的影響.當(dāng)緩沖鹽的pH在5.5～7.0時，馬布特羅對映體可以得到一定的分離；但當(dāng)緩沖鹽的pH低于5.5時不能實現(xiàn)分離.在反相模式下，可選用的有機(jī)改性劑包括甲醇、乙醇、異丙醇、乙腈、四氫呋喃等，本文考察了它們的類型和濃度對馬布特羅對映體保留行為和分離效果的影響.乙醇被證明是適用于此固定相的最佳選擇；當(dāng)采用異丙醇或四氫呋喃作為有機(jī)改性劑時分離效果較差；采用甲醇或乙腈時不能實現(xiàn)手性分離.隨著乙醇在流動相中含量由10%增加至70%，馬布特羅的保留時間隨之延長，而分離因子和分離度在流動相中含有30%乙醇時達(dá)到此模式下的極大值.其中乙醇含量對化合物保留行為的影響不符合通常的反相行為，這表明離子化作用在化合物洗脫和對映體分離時具有決定性作用.因此，此模式下最佳流動相被確定為0.1%TEAA（pH 6.0）-30%乙醇，流速0.6mL/min.在此流動相條件下，馬布特羅對映體可實現(xiàn)部分分離，分離因子（α）和分離度Rs分別為1.04和0.22.

2.3 正相模式下馬布特羅對映體的手性分離

在正相模式下，考察了兩種流動相系統(tǒng)：正己烷/乙醇和正己烷/異丙醇，并且通過改變流動相組成以求實現(xiàn)手性分離.令人失望的是，在此模式下，鹽酸馬布特羅對映體在三種大環(huán)抗生素手性固定相上均不能實現(xiàn)分離.

2.4 分離機(jī)制的探討

萬古霉素，替考拉寧和利托菌素分別是Chirobiotic V，T和R色譜柱的手性選擇劑，它們的結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，含有不同的手性中心，包合空腔和各種官能團(tuán).由于其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，它們可與被分離的對映體發(fā)生π-π相互作用，氫鍵作用，包合作用，偶極作用，立體化學(xué)作用和離子相互作用.鹽酸馬布特羅的結(jié)構(gòu)中具有苯環(huán)，羥基，鹵素和氨基基團(tuán)，可以與手性選擇劑上相應(yīng)的官能團(tuán)發(fā)生相互作用從而實現(xiàn)手性分離.新極性有機(jī)相模式可以提升所有這些相互作用，因此在此模式下，鹽酸馬布特羅對映體可實現(xiàn)較好的分離.而在新極性有機(jī)相模式下，必須有三乙胺存在于流動相中才可實現(xiàn)對鹽酸馬布特羅對映體的分離，當(dāng)流動相中同時含有三乙胺和冰醋酸時，分離效果最佳，這說明離子作用是此模式下對映體分離的最主要作用機(jī)制，而鹽酸馬布特羅的手性分離是上述提到的各種相互作用的共同結(jié)果.

在反相模式下，馬布特羅對映體的分離受流動相中緩沖鹽pH的影響很大，這是因為馬布特羅和手性固定相的結(jié)構(gòu)中均含有可離子化基團(tuán)，流動相的pH能夠影響它們的離子化狀態(tài)以及手性選擇劑的構(gòu)型，從而影響兩者之間的離子相互作用，進(jìn)而影響分離結(jié)果，這說明在反相模式下，離子相互作用也是影響對映體分離的最主要作用.當(dāng)考察流動相中有機(jī)溶劑含量對保留行為和分離的影響時，發(fā)現(xiàn)其保留時間的變化不符合通常的反相行為，隨著流動相中乙醇含量的增加，分析物的保留時間反而延長，亦表明離子化作用在化合物洗脫和對映體分離時具有決定性作用.

在正相模式下，鹽酸馬布特羅對映體不能得到分離，這進(jìn)一步證明了離子相互作用在鹽酸馬布特羅對映體分離時的必要性.因為離子相互作用在正相模式下是很難，甚至不可能發(fā)生的，而鹽酸馬布特羅對映體分離最主要的機(jī)制就是通過離子相互作用，所以才致使其對映體在正相模式下不能實現(xiàn)分離.

鹽酸馬布特羅對映體在Chirobiotic V和T固定相上均可得到較好的基線分離，而在Chirobiotic R固定相上卻沒能實現(xiàn)手性分離，這主要是由于三種固定相的手性選擇劑的結(jié)構(gòu)存在差異.盡管替考拉寧和利托菌素的結(jié)構(gòu)有些相似，但是兩者之間最顯著的差異就是在利托菌素的結(jié)構(gòu)中含有相對多的半糖結(jié)構(gòu)，但缺少羧基.鹽酸馬布特羅對映體在Chirobiotic R固定相上不能實現(xiàn)分離的現(xiàn)象表明固定相結(jié)構(gòu)中的羧基是與被分析物發(fā)生離子相互作用的重要手性位點之一，而且進(jìn)一步證明了離子相互作用是實現(xiàn)對映體分離的最必要作用.手性固定相中的半糖等結(jié)構(gòu)可以為對映體提供手性空腔，使對映體由于立體結(jié)構(gòu)差異而實現(xiàn)手性分離.因此，鹽酸馬布特羅對映體在Chirobiotic R固定相上不能實現(xiàn)分離的現(xiàn)象可以解釋為Chirobiotic R固定相缺少能與分析物發(fā)生離子相互作用的位點，且由半糖結(jié)構(gòu)所形成的手性空腔不適合鹽酸馬布特羅對映體的分離.

3 結(jié)論

采用三種大環(huán)抗生素類手性固定相Chirobiotic V，T和R對鹽酸馬布特羅進(jìn)行了拆分研究，在Chirobiotic V，T手性固定相上成功實現(xiàn)了其對映體的基線分離，最大分離度可分別達(dá)3.08和3.73.本文中建立的鹽酸馬布特羅拆分方法簡單，操作方便，可以用于其對映體的質(zhì)量控制及立體選擇性藥代動力學(xué)的研究.

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