成巨龍，羅晶，鄒航，柯美福，牛俞德，安德榮

1 陜西省煙草公司，西安 710061;

2 西北農(nóng)林科技大學(xué)，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100

植物保護(hù)

陜西煙草青枯病的發(fā)生與病原鑒定

成巨龍1，羅晶2，鄒航2，柯美福1，牛俞德1，安德榮2

1 陜西省煙草公司，西安 710061;

2 西北農(nóng)林科技大學(xué)，旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100

2013年7月在陜西省西鄉(xiāng)縣韓嶺村煙田首次發(fā)現(xiàn)疑似煙草青枯病病株,為了解陜西煙草青枯病的發(fā)生危害，對(duì)陜西省不同煙區(qū)的煙草青枯病的發(fā)生情況進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查，并對(duì)田間采集的具有典型青枯病癥狀的煙草莖部樣本進(jìn)行了病原鑒定。結(jié)果表明：陜西省煙草青枯病發(fā)生區(qū)域?yàn)殛兡系臐h中、安康和商洛3個(gè)煙區(qū)，延安、寶雞和咸陽(yáng)的三個(gè)煙區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)。發(fā)病始于6月上旬，盛發(fā)于7月中旬。該病害隨溫度升高而病情加劇，發(fā)病早期田間死苗嚴(yán)重，發(fā)病率可高達(dá)24.67%，而且有蔓延擴(kuò)展趨勢(shì)；通過(guò)對(duì)煙草莖稈上分離的病原細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)觀察、致病性測(cè)定、生理生化性狀等常規(guī)細(xì)菌鑒定比較，結(jié)合細(xì)菌16S rDNA序列分析，鑒定該病原菌為青枯勞爾氏菌Ralatonia solanacearum。

煙草青枯?。徊≡b定；青枯勞爾氏菌

煙草青枯病是一種嚴(yán)重危害煙草生長(zhǎng)和品質(zhì)的頑固性細(xì)菌病害，煙草感病后會(huì)造成嚴(yán)重產(chǎn)量和質(zhì)量損失。該病常發(fā)生在熱帶、亞熱帶及部分溫帶地區(qū)。目前我國(guó)該病主要在長(zhǎng)江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生，其中以廣東、福建、臺(tái)灣、湖南、江西、廣西東部、安徽南部、四川、云南及貴州局部煙區(qū)為害嚴(yán)重[1-2]，個(gè)別年份常常暴發(fā)流行，造成毀滅性損失。由于溫室效應(yīng)的加劇，該病的發(fā)生危害有向北方煙區(qū)擴(kuò)展的趨勢(shì)，目前在山東、河南及遼寧等省相繼有發(fā)生報(bào)道[3]，且局部地區(qū)危害較重。陜西地處中國(guó)內(nèi)陸腹地，黃河和長(zhǎng)江流域中部，陜西煙田青枯病的發(fā)生、危害和癥狀特點(diǎn)及發(fā)病規(guī)律等尚無(wú)報(bào)道。本文針對(duì)上述問(wèn)題，結(jié)合全國(guó)煙草有害生物第二次調(diào)查要求，對(duì)煙草青枯病在陜西的發(fā)生情況、癥狀和病原菌鑒定進(jìn)行了系統(tǒng)研究。

1 材料

培養(yǎng)基:LB固體培養(yǎng)基（胰蛋白胨 10 g/L，酵母浸粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15～20 g/L）；TTC培養(yǎng)基（胰蛋白胨 17 g/L，大豆胨3 g/L，NaCl 2.5 g/L，葡萄糖6 g/L，硫乙醇酸鈉0.5 g/L，L-胱氨酸0.25 g/L，亞硫酸鈉0.1 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 7.2±0.1）。供試煙草：NC89。IQ5定量PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品；DK-8D型電熱恒溫水槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，上海琪特分析儀器有限公司產(chǎn)品；CP100WX超速離心機(jī)，日本日立公司產(chǎn)品；H6-1微型電泳槽，上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠產(chǎn)品；Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品；NICOLET300紫外分光光度計(jì)，美國(guó)熱電公司產(chǎn)品；3130XL DNA自動(dòng)測(cè)序儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；DV805A TaKaRa膠回收試劑盒，寶生物工程（大連）有限公司。

2 方法

2.1 病害調(diào)查和樣本采集

在2010—2013年全國(guó)煙草有害生物第二次調(diào)查時(shí)，在陜西6個(gè)地區(qū)18個(gè)不同生態(tài)條件的煙田進(jìn)行采樣和調(diào)查，其中在陜西省漢中、安康和商洛煙區(qū)均發(fā)現(xiàn)有典型煙草青枯病癥狀的煙株。在田間切取8 ㎝左右感病莖桿，裝入封口塑料袋中帶回進(jìn)行病原分離、鑒定。

采取定點(diǎn)觀察的方法，選擇陜西省安康市旬陽(yáng)縣、寶雞市隴縣、漢中市西鄉(xiāng)縣、延安市富縣、咸陽(yáng)市旬邑縣以及商洛市鎮(zhèn)安縣等煙田進(jìn)行病害系統(tǒng)調(diào)查。首先在烤煙旺長(zhǎng)期進(jìn)行大田觀察，發(fā)現(xiàn)病株后進(jìn)行定點(diǎn)定株定時(shí)觀察，選取同一地點(diǎn)的100株病株，每隔3 d觀察發(fā)病情況，至收獲。其次,在大田煙草青枯病病情基本穩(wěn)定后進(jìn)行一次病情調(diào)查，了解大田中煙草的發(fā)病情況,采用對(duì)角線五點(diǎn)取樣法，每個(gè)點(diǎn)選取50株，統(tǒng)計(jì)田間發(fā)病率。

2.2 病原分離和純化

分離病菌前，將莖稈沖洗干凈，用75%的酒精對(duì)莖稈和小刀消毒，然后在無(wú)菌條件下，用小刀剖開(kāi)莖稈上的病斑，將感病維管束組織切成若干小塊，用無(wú)菌的鑷子夾取煙塊于直徑為10㎝的含LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿中放4～5塊，重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度為28℃～30℃，培養(yǎng)48 h[4]，待煙塊于培養(yǎng)基接觸處長(zhǎng)出白色流動(dòng)性菌落并且向外分散細(xì)小絲狀菌塊時(shí)，挑取菌落少許，在TTC培養(yǎng)基上劃線分離，每個(gè)樣本挑取呈典型的青枯勞爾氏菌落形態(tài)（中央呈粉紅色、周圍乳白色、流動(dòng)性較強(qiáng)）的單菌落在TTC培養(yǎng)基上劃線純化。

2.3 致病性測(cè)定

供試煙草品種為NC89。在盆缽內(nèi)將煙草種子播種后，待煙株生長(zhǎng)到有維管束組織時(shí)（5-6片葉），用小刀在煙草莖基部切一斜口，用膠頭滴管將事先培養(yǎng)好的病原菌懸液滴在開(kāi)口處，并用蘸有菌液的棉球包在傷口處、煙苗外套保鮮袋保濕。以滅菌水作對(duì)照，過(guò)一段時(shí)間觀察發(fā)病狀況[4]。

2.4 病原鑒定

2.4.1 病原菌的生理生化特性

取培養(yǎng)18 h的細(xì)菌單菌落，涂于載玻片上進(jìn)行負(fù)染色，電鏡下觀察菌體的形態(tài)大小、鞭毛特性；菌體的菌落特征及生理生化指標(biāo)測(cè)定參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]。菌落形態(tài)主要觀察單菌落形狀、大小、顏色、表面、邊緣、隆起特性、透明度等。生理生化主要進(jìn)行糖類發(fā)酵試驗(yàn)、石蕊牛乳試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、吲哚及氨的產(chǎn)生試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)、產(chǎn)生硫化氫試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)8個(gè)指標(biāo)。

2.4.2 病原菌16S rDNA序列的測(cè)定

從已進(jìn)行致病性測(cè)定的菌株中選出致病性最強(qiáng)的菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，以f27/r1492為引物（f27：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；r1492：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）[6]。PCR 反應(yīng)采用25μL體系：10×Buffer 2.5μL、上游引物（10 μM） 0.5μL、下游引物（10μM）0.5μL、dNTP mix(10Mm each)0.5μL、Tap（5u/μL）0.2μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性 5min；94℃ 30 s，55℃ 35 s，75℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行制備形瓊脂糖凝膠電泳，采用膠回收法回收。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，所獲得的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST同源性分析

2.5 回接實(shí)驗(yàn)和再分離

取同源性最高的菌株，在TTC平板上28℃活化培養(yǎng)，36h后將菌苔刮下，用無(wú)菌水配成濃度為3×108CFU/ml的菌懸液用于接種。盆栽NC89漂浮苗，成活后用刀傷根，每根灌菌懸液10ml。以自來(lái)水為對(duì)照。每菌株接種3株，常規(guī)管理。接種后每隔4d觀察癥狀[7]。在煙株表現(xiàn)莖部和下部葉片黑色壞死后，取樣分離病菌，并對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，驗(yàn)證是否為青枯勞爾氏菌。

3 結(jié)果與分析

3.1 陜西煙田發(fā)病概況

根據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)，煙草青枯病發(fā)生區(qū)域?yàn)殛兡蠞h中、安康和商洛等三個(gè)煙區(qū)，最高發(fā)病率可達(dá)24%以上，延安、寶雞和咸陽(yáng)等三個(gè)煙區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)。通過(guò)系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)，田間煙草青枯病6月上旬開(kāi)始發(fā)病，7月中旬盛發(fā)，時(shí)雨時(shí)晴的悶熱天氣病情發(fā)展較快，隨溫度升高病情加劇。發(fā)病30d后，病情有所緩慢。此外，地勢(shì)低洼以及有積水的田塊，煙草青枯病發(fā)病較重，沿溝渠兩岸的沙質(zhì)土壤上所種植的煙草發(fā)病也較為嚴(yán)重。

3.2 病原菌的分離及致病性測(cè)定

從感病的煙株中分離純化后得到5個(gè)菌株JL 1、JL 2、JL3、JL4和JL5。2013年7月23日將分離的供試菌株JL1、JL2、JL 3、JL 4和JL 5分別接種20株煙株，經(jīng)過(guò)15～20 d后接種煙株均出現(xiàn)典型的青枯病癥狀：發(fā)病初期煙株葉片萎蔫下垂，隨后萎蔫葉片自下而上變黃、枯死，但是葉片的主脈和側(cè)脈常不變黃；在莖稈基部的外表皮上常伴有明顯的黑褐色病斑，若用刀橫切莖基部，剖開(kāi)表皮，發(fā)現(xiàn)維管束變褐且有污白色菌膿（如圖1）。接種JL1菌株的煙株發(fā)病率最高達(dá)80%。

圖1 青枯病癥狀Fig.1 Bacterial wilt symptoms

3.3 病原菌的生理生化特性

JL1菌株在LB培養(yǎng)基上，菌落為圓形，稍突起，乳白色有光澤。在TTC培養(yǎng)基上，菌落中央呈粉紅色，周圍乳白色，流動(dòng)性強(qiáng)，呈現(xiàn)典型的青枯勞爾氏菌菌落形態(tài)(如圖2)。病原菌為短桿狀，大小為1.56～2.28×0.59～0.91μm（如圖3）。該病原菌生物化學(xué)性狀的測(cè)定結(jié)果如表2。

圖2 LB培養(yǎng)基(a)和TTC培養(yǎng)基（b）上的病原菌菌落形態(tài)Fig.2 Pathogen colony morphology on the LB culture medium（a）and TTC culture medium(b)

圖3 透射電鏡（a）和掃描電鏡（b）下病原菌形態(tài)Fig.3 Pathogen bacteria morphology under the transmission electron microscope(a)and scanning electron microscopy(b)

表2 病原菌生物化學(xué)性狀測(cè)定結(jié)果Tab.2 Determination of biochemical properties of pathogenic bacteria

3.4 病原菌的16SrDNA序列測(cè)定

以JL1基因組DNA為模板，用f 27/r1492引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)得該菌株的16S rDNA核苷酸序列長(zhǎng)度為1500bp，GenBank登錄號(hào)為KF668096，通過(guò)與NCBI中模式菌株的16S rDNA序列比對(duì)分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，JL1菌株與青枯勞爾氏菌（Genbank登錄號(hào)為FJ494776）同源性最近，相似性為99%，16S rDNA序列分析結(jié)果，JL1菌株為青枯勞爾氏菌（圖4）。

圖4 菌株JL1系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strains jumpers JL1

3.5 菌株的回接與再分離

菌株的回接試驗(yàn)表明，煙苗表現(xiàn)典型的青枯病癥狀：莖上一側(cè)褐色壞死條斑，病側(cè)部分根系變黑腐爛，下部葉片黃化萎蔫。病苗樣品在TTC培養(yǎng)基上分離得到典型青枯勞爾氏菌菌落。經(jīng)過(guò)對(duì)16S rRNA序列同源性分析，表明該病菌屬于青枯勞爾氏菌。

4 結(jié)論與討論

煙草青枯病是由青枯勞爾氏菌Ralatonia solanacearumE.F Smith（曾用名Pseudomonas solanacearumSmith[2]，或Burkholderia solanacearum，1996年由IJSB正式更名為青枯勞爾氏菌[12]）引起的一種土傳病害[8]。是一種高溫高濕型病害，低溫高濕或高溫干旱都不能使病害發(fā)生和流行。發(fā)病最適宜的溫度為30℃～35℃。濕度是影響該病發(fā)病流行的另一重要因素。雨量多濕度大，病害發(fā)展快，為害重，相反雨量少，濕度低，病害發(fā)展受到抑制，為害相對(duì)較輕。煙株一旦染病常造成整株死亡，其危害往往是毀滅性的，因此，給煙草生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[2,9-11]。

在2010～2013年全國(guó)煙草有害生物第二次調(diào)查時(shí)，在陜南3個(gè)煙區(qū)首次發(fā)現(xiàn)煙草青枯病，調(diào)查還發(fā)現(xiàn)該病在陜西6月上旬開(kāi)始發(fā)病，7月中旬盛發(fā)，時(shí)雨時(shí)晴的悶熱天氣病情發(fā)展較快，隨溫度升高而加劇。通過(guò)對(duì)典型病株的病原進(jìn)行分離、純化、回接、顯微形態(tài)觀察、生理生化測(cè)定以及16SrDNA序列測(cè)定表明，該細(xì)菌屬于青枯勞爾氏菌，短桿狀，大小為1.56—2.28×0.59—0.91μ，在肉汁培養(yǎng)基上，菌落為圓形，稍突起，乳白色有光澤，在TTC培養(yǎng)基上，菌落中央呈粉紅色，周圍乳白色，流動(dòng)性強(qiáng)。生理生化特性研究表明，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，可使石蕊牛乳胨化，不能使明膠液化，不能還原硝酸鹽，產(chǎn)氨不產(chǎn)吲哚，能產(chǎn)生乙酰甲基醇和硫化氫，不能水解淀粉。

將菌懸液接種于健康煙草莖基部，莖均發(fā)病，且致病性較強(qiáng)，說(shuō)明該致病菌對(duì)煙草危害較大，若不及時(shí)防治，將會(huì)對(duì)煙草造成毀滅性的危害。本文通過(guò)對(duì)煙草青枯病在陜西的發(fā)生情況、癥狀、病原鑒定進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為下一步防治煙草青枯病提供了理論依據(jù)。

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Identification of tobacco bacterial wilt pathogen in Shaanxi

CHENG Julong1,LUO Jing2,ZOU Hang2,KE Meifu1,NIU Yude1,AN Derong2

1 Shaanxi Provincial Tobacco Company,Xi’an,710061,China;
2 State Key Laboratory of Crop Biology Adversity in Arid Regions,Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling,Shaanxi 712100,China

Tobacco bacterial wilt in Shaanxi was investigated using samples typical of wilt symptoms.Results showed that bacterial wilt occurred in tobacco growing areas of southern Shaanxi province including Hanzhong,Ankang and Shangluo.No bacterial wilt disease was observed in other tobacco growing areas such as Yan'an,Baoji and Xianyang.It broke out in early June and prevailed in the middle of July,indicating that it aggravated in line with rising temperature( with incidence of up to 24.67%).Morphology observation,pathogenicity determination,physiological and biochemical identification in combination with 16S rDNA sequence analysis showed that the pathogen wasRalatonia solanacearum.

tobacco bacterial wilt; identification of pathogen;Ralatonia solanacearum

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.05.014

S43 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1004-5708（2014）05-0087-06

陜西煙草有害生物調(diào)查（KJ-2010-04）

成巨龍（1959—）研究員，主要研究方向?yàn)闊煵莶『?，Tel：029-85466136，Email：julongc@126.com

2013-09-22