趙華俊 林 昂 韓秋菊 張 建 (山東大學(xué)藥學(xué)院免疫藥理與免疫治療學(xué)研究所，濟(jì)南250012)

Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是一類模式識別受體，在生物體進(jìn)化過程中高度保守[1]。大量研究表明，TLRs在多種細(xì)胞中均有表達(dá)，其中以免疫細(xì)胞表達(dá)為主，如樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等[1，2]。TLRs的活化在宿主抵抗外來病原體感染和組織損傷的天然免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著重要作用，并可以通過多種機(jī)制間接調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答。

早期的研究主要是立足于表達(dá)在免疫細(xì)胞上TLRs的生物學(xué)功能及其重要性。然而近年的研究發(fā)現(xiàn)，TLRs在一些腫瘤細(xì)胞，如黑色素瘤細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等均有表達(dá)。而TLRs對不同種類腫瘤細(xì)胞發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。例如，人頭頸部鱗癌細(xì)胞系上的TLR4活化后能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，并保護(hù)腫瘤免受免疫系統(tǒng)攻擊[3];乳腺癌細(xì)胞的TLR5在活化后能夠抑制細(xì)胞增殖，從而抑制腫瘤的生長[4，5]。因此，研究 TLR激動劑對腫瘤的直接作用，對于腫瘤的免疫治療具有重要的意義。

polyI:C是一種病毒雙鏈RNA的模擬物，已有文獻(xiàn)報道，它不僅對免疫細(xì)胞(如自然殺傷細(xì)胞)具有激活作用，而且還可以直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[4]，已作為一種有效的抗腫瘤免疫佐劑被廣泛研究。由于所處的特殊生理環(huán)境，肝臟部位長期接觸腸道菌群及其產(chǎn)物，難以避免與細(xì)菌成分脂多糖(LPS)相接觸。本文旨在探討LPS對polyI:C誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的影響并進(jìn)行初步的機(jī)制探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人肝癌細(xì)胞系H7402購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(北京，中國)，并在本實驗室保存。

1.1.2 試劑 RPMI1640購于Gibco公司;胰酶購自上海生工生物工程有限公司;新生牛血清、胎牛血清購自杭州四季青公司;LPS、polyI:C購于Sigma公司;DMSO購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Lipofectin2000、Trizol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自美國Invitrogen公司;SYRB Green Mix購自日本ToYoBo公司;Western blot檢測RIG-I、MDA5抗體購自美國CST公司;TLR4阻斷劑TAK242購自美國Invivogen公司;三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等其他試劑為國產(chǎn)分析純，引物由北京華大基因有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞干預(yù) H7402細(xì)胞以含有10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2的條件下。將細(xì)胞接種于12孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用 LPS(10 μg/ml)預(yù)處理 24 h;進(jìn)行polyI:C(1 μg/ml)轉(zhuǎn)染6 h后，更換有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h，然后進(jìn)行下一步檢測。

1.2.2 熒光定量PCR 參照Trizol說明書，Trizol法提取方法1.2.1處理細(xì)胞的總RNA。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR反應(yīng)，或采用熒光定量PCR的方法檢測凋亡相關(guān)基因 Bad、Bax、Bim、Bad、Noxa、Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1 及 polyI:C 的胞內(nèi) RNA 識別受體 RIG-I、MDA5、TLR3、LGP2的表達(dá)水平。該方法使用 SYBR Green Master Mix，iCycleriQ Realtime PCR儀進(jìn)行檢測。所用到的引物序列見表1。

1.2.3 Western blot法檢測細(xì)胞RIG-I、MDA5蛋白表達(dá)水平[6]各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后采用蛋白裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白;經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的1×TBST液封閉，然后分別以相應(yīng)的一抗、二抗標(biāo)記，最后，PVDF膜于Bio-RAD成像儀上以化學(xué)發(fā)光法曝光顯影。

1.2.4 PI/Annexin V雙染法檢測細(xì)胞凋亡 收集方法1.2.1處理的細(xì)胞于流式管中，1×PBS清洗一遍，200 μl Annexin V結(jié)合液重懸細(xì)胞，混勻，每管加入2.5 μl FITC-Annexin V染液，4℃避光孵育15 min，每管再加入 PI 5 μl，4℃避光孵育 5 min 后，用流式細(xì)胞儀檢測。

表1 用于定量PCR的引物序列Tab．1 Primer sequences used for Real-time quantitative PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 兩組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗。P＜0.05認(rèn)為有差異，P＜0.01為具有顯著性的統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 LPS可抑制polyI:C誘導(dǎo)的H7402細(xì)胞凋亡如圖1A顯示，H7402細(xì)胞表達(dá)TLR3、TLR4;經(jīng)10 μg/ml LPS 刺激24 h，再轉(zhuǎn)染 polyI:C(1 μg/ml)作用24 h，細(xì)胞凋亡程度明顯低于polyI:C單處理組，提示LPS可能有抵抗polyI:C誘導(dǎo)H7402細(xì)胞凋亡的作用，見圖1B，圖1C所示內(nèi)容為圖1B的統(tǒng)計圖。

圖1 LPS可抑制polyI:C誘導(dǎo)的H7402細(xì)胞凋亡Fig．1 LPS inhibits polyI:C-induced the apoptosis of H7402 cells

圖2 LPS可通過TLR4信號通路抑制polyI:C誘導(dǎo)的H7402細(xì)胞凋亡Fig．2 LPS inhibits induced H7402 via TLR4 signaling pathway

2.2 LPS通過TLR4信號通路抑制polyI:C誘導(dǎo)的H7402細(xì)胞凋亡 為研究LPS是否通過激活TLR4通路而減弱polyI:C誘導(dǎo)的H7402細(xì)胞凋亡，首先使用TLR4阻斷劑TAK242處理H7402細(xì)胞2 h，然后加入10 μg/ml LPS刺激 24 h，再轉(zhuǎn)染 1 μg/ml polyI:C刺激24 h。檢測結(jié)果如圖2顯示，TLR4被阻斷后，LPS將不影響polyI:C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明LPS對polyI:C誘導(dǎo)凋亡的影響可能是通過TLR4信號通路介導(dǎo)的。

2.3 LPS預(yù)處理可影響細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)為研究LPS是否影響polyI:C所誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)基因表達(dá)，采用熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示，polyI:C單獨刺激可以顯著上調(diào)Noxa表達(dá)，但經(jīng)LPS預(yù)處理后，Noxa表達(dá)上調(diào)的幅度顯著下降;而促凋亡基因Bad、Bax、Bim、Bid及抑凋亡基因Bcl-x1的表達(dá)無明顯差異，雖然抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)略微有所上升，Mcl-1表達(dá)略微有所下降，但是因為細(xì)胞凋亡是一個多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，在此細(xì)胞凋亡過程中Bcl-2、Mcl-1微小變化可能并不是關(guān)鍵性的因素，而發(fā)生顯著性變化的Noxa可能發(fā)揮更直接的作用(圖3)。

圖3 LPS的預(yù)處理對H7402細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig．3 LPS pre-treatment influenced the expression of the apoptosis genes

圖4 LPS可抑制polyI:C誘導(dǎo)RNA模式識別受體的表達(dá)Fig．4 LPS pretreatment suppresses the expression of intracellular recognition receptors induced by polyI:C

2.4 LPS對H7402細(xì)胞RNA模式識別受體表達(dá)的影響 為進(jìn)一步研究LPS對polyI:C凋亡影響的可能機(jī)制，熒光定量PCR方法檢測，polyI:C胞內(nèi)相關(guān)識別受體發(fā)現(xiàn)H7402細(xì)胞經(jīng)LPS預(yù)處理后，MDA5、RIG-I基因表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖4A)，而 LGP2、TLR3表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化(數(shù)據(jù)未顯示);同時Western blot方法檢測;經(jīng)LPS預(yù)處理后，H7402細(xì)胞MDA5、RIG-I蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)(圖4B)，提示LPS預(yù)處理可能導(dǎo)致了polyI:C的胞內(nèi)識別受體MDA5、RIG-I表達(dá)下降，影響了polyI:C與受體的結(jié)合，從而阻礙polyI:C發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

3 結(jié)論

TLRs作為重要的模式識別受體，不僅表達(dá)在免疫細(xì)胞上，在多種腫瘤細(xì)胞及組織中也廣泛表達(dá)[7-9]。一方面，免疫細(xì)胞中TLRs的活化，參與了機(jī)體抵抗外來病原體感染的天然免疫應(yīng)答過程，而TLRs激動劑由于其特有的免疫刺激活性，也被廣泛地用于免疫佐劑的研究中[10]。另一方面，腫瘤細(xì)胞表面TLRs所介導(dǎo)的下游炎癥因子的產(chǎn)生，參與了腫瘤微環(huán)境的形成，進(jìn)而對腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了不同的作用[11-13]。而不同TLRs家族成員信號通路之間的交互作用使得TLRs的生物學(xué)功能更為復(fù)雜。對于腫瘤細(xì)胞的不同TLRs配體之間的相互作用的研究有待進(jìn)一步深入研究。

為了觀察LPS對polyI:C誘導(dǎo)H7402細(xì)胞凋亡的影響，我們采用LPS刺激細(xì)胞24 h，再轉(zhuǎn)染polyI:C作用24 h，細(xì)胞凋亡程度明顯低于polyI:C單處理組，說明LPS可能具有抵抗polyI:C誘導(dǎo)H7402細(xì)胞凋亡的作用。為了研究LPS是否通過激活TLR4通路減弱polyI:C誘導(dǎo)H7402細(xì)胞凋亡，我們使用TLR4阻斷劑TAK242處理H7402細(xì)胞2 h，再加入LPS刺激24 h，轉(zhuǎn)染polyI:C刺激24 h。結(jié)果顯示，TLR4被阻斷后，LPS將不影響polyI:C誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，表明LPS對polyI:C誘導(dǎo)凋亡的影響可能是通過TLR4信號通路介導(dǎo)的。

細(xì)胞凋亡過程受一系列相關(guān)基因的調(diào)控，包括促凋亡基因(Noxa、Bim)和抗凋亡基因(Bcl-xl、Bcl-2)等。為了研究LPS是否影響polyI:C所誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，我們采用熒光定量PCR方法檢測結(jié)果顯示，polyI:C單獨刺激可以顯著上調(diào)H7402細(xì)胞Noxa的表達(dá)，但經(jīng)LPS預(yù)處理后，Noxa上調(diào)幅度顯著下降;而促凋亡基因Bad、Bax、Bim、Bid及抑凋亡基因Bcl-xl、Bcl-2的表達(dá)無明顯變化。雖然，polyI:C刺激H7402細(xì)胞后，抑凋亡基因Mcl-1的表達(dá)也上調(diào)，但其上調(diào)幅度顯著低于Noxa且不受LPS的影響。這些現(xiàn)象提示，與Noxa相比，Mcl-1可能不是polyI:C誘導(dǎo)H7402細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵性因素。PolyI:C主要被細(xì)胞內(nèi)RNA模式識別受體所識別，包括 TLR3、RIG-1、MDA5和 LGP2，進(jìn)而介導(dǎo)下游信號通路的活化，發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。我們觀察到，將H7402細(xì)胞經(jīng)LPS處理后，polyI:C識別受體MDA5、RIG-I基因及蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，而LGP2、TLR3表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。表明LPS預(yù)處理影響了polyI:C與受體的結(jié)合，從而阻礙polyI:C發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

polyI:C能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14-17]，這對抗腫瘤藥物的研發(fā)及臨床應(yīng)用提供了新的策略。對于肝癌細(xì)胞，polyI:C具有同樣促凋亡作用。但由于肝臟所處的特殊生理環(huán)境，其長期不斷地受到腸道菌群的侵襲，難以避免與細(xì)菌內(nèi)毒素LPS接觸[1]。本文研究結(jié)果提示，在臨床應(yīng)用polyI:C進(jìn)行肝癌的免疫治療時，聯(lián)合小分子藥物阻斷TLR4，可能是一種有效的新型治療策略。

[1]Zhang Y，Qu J，Zhang J.The effects of TLR4 activation on the characterizations of digestive system associated cancers[J].Chin J Immun，2012，28(8):695-700.

[2]Chrystal MP，Andrew K，Claudia W，et al.Toll-like Receptors in Tumor Immunotherapy[J].Clin Cancer Res，2007，13(18):5280-5289.

[3]Michael G，Kelly，Ayesha B，et al.TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer[J].Cancer Res，2006，66(7):3859-3868.

[4]Bruno S，Isabelle C，Rissoan MC，et al.TLR3 can directly trigger apotosis in human cancer cells[J].J Immunol，2006，176(8):4894-4901.

[5]Claire JG，Stefan RJ，Rami L，et al.IL-6 trans-signaling modulates TLR4-depengdentinflammatory responses via STAT3[J].J Immunol，2011，186(2):1199-1208.

[6]Wang J，Yu S，Chen C，et al.Immunomodulatory effects fo polysaccharopeptide on TLR signaling pathway of PBMC through MyD88 in patients with breast cancer[J].Chin J Immun，2013，29(3):236-239.

[7]Kumagai Y，Takeuchi O，Akira S.Pathogen recognition by innate receptors[J].J Infect Chemother，2008，14(2):86-92.

[8]Szczepanski MJ，Czystowska M，Szajnik M，et al.Triggering of toll-like receptor 4 expressed on human head and neck squamous cell carcinoma promotes tumor development and protects the tumor from immune attack [J].Cancer Resarch，2009，69(7):3105-3113.

[9]Sato Y，Goto Y，Narita N，et al.Cancer cells expressing toll-like receptors and the tumor microenvironment[J].Cancer Microenviron，2009，2(1):205-214.

[10]Seth RN，Ruslan M.Toll-like receptors and cancer[J].Nature Reviews Cancer，2009，9(1):57-63.

[11]Curtin JF，Liu N，Candolfi M，et al.HMGB1 mediates endogenous TLR2 activation and brain tumor regression [J].PLoS Med，2009，6(1):10.

[12]Fukata M，Chen A，Vamadevan AS，et al.Toll-like receptor-4 promotes the development of colitis-associated colorectal tumors[J].Gastroenterology，2007，133(6):1869-1881.

[13]Goto Y，Arigami T，Kitago M，et al.Activation of Toll-like receptors 2，3，and 4 on human melanoma cells induces inflammatory factors[J].Mol Cancer Ther，2008，7(11):3642-3653.

[14]Sun X，Zhang J，Wang L，et al.Growth inhibition of human hepatocellar carcinoma cells by blocking STAT3 activation with decoy-ODN [J].Cancer Lett，2008，262(2):201-213.

[15]Apetoh L，Ghiringhelli F，Tesniere A，et al.Toll-like receptor 4-dependent contribution of the immune system to anticancer chemotherapy and radiotherapy[J].Nat Med，2007，13(9):1050-1059.

[16]Huang B，Zhao J，Li H，et al.Toll-like receptors on tumor cells facilitate evasion of immune surveillance[J].Cancer Res，2005，65(12):5009-5014.

[17]Chen R，Alvero AB，Silasi DA，et al.Inflammation，cancer and chemoresistance:taking advantage of the toll-like receptor signaling pathway[J].Am J Reprod Immunol，2007，57(2):93-107.