趙銘佳，周善杰，袁冬，邱實(shí)，楊鎰魟，楊向祎，周芳，盧文紅，梁曉薇，谷翊群＊

（1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.國家衛(wèi)生計生委男性生殖健康重點(diǎn)實(shí)驗室，國家人口計生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京 100081）

血清同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是體內(nèi)甲硫氨酸循環(huán)的正常代謝產(chǎn)物，是許多需甲基化反應(yīng)和能量代謝的重要中間產(chǎn)物。許多學(xué)者做了大量關(guān)于血清Hcy與心腦血管疾病關(guān)聯(lián)性研究，認(rèn)為血清Hcy增高是動脈硬化的危險因子［1］。高血清Hcy還與某些內(nèi)分泌疾病、腫瘤疾病、自身免疫性疾病以及神經(jīng)退行性疾病有關(guān)系［2］。近些年越來越多的證據(jù)表明，Hcy代謝途徑在生育力方面占有非常重要的地位［3，4］。本研究旨在探討建立精漿Hcy的正常值參考范圍，血清、精漿Hcy，精漿Hcy總含量與精液參數(shù)的關(guān)聯(lián)性以及精漿Hcy濃度與血清Hcy濃度關(guān)聯(lián)性的研究。

材料和方法

一、材料

1.精漿和血清樣本：從北京人類精子庫捐精者中招募了31例健康志愿者，排除心、肝、腎等重要臟器疾病，近3個月無用藥史，年齡22～35周歲。精液常規(guī)分析按照《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗室手冊》第五版［5］進(jìn)行分析。本項研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)，所有提供精子樣本的志愿者簽署書面知情同意書。

2.主要試劑及儀器：采用北京百奧萊博科技有限公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒，其試驗批內(nèi)誤差小于9%，批間誤差小于15%；BioTek ELx800酶標(biāo)儀（伯騰，美國）、BioTek ELx50洗板機(jī)（伯騰，美國）、Megafuge 1.0R 離心機(jī)（賀利，德國）、Thermo Fresco 21離心機(jī)（賀利，德國）等。

二、實(shí)驗方法

1.精漿制備：按《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗室手冊》第五版要求，所有志愿者均禁欲3～7d，手淫法留取精液于清潔無菌杯中。37℃水浴箱內(nèi)孵育30min，精液液化后做常規(guī)分析，主要包括精液量、精子濃度、精子活力等指標(biāo)。檢測后將精液置于Thermo Fresco 21離心機(jī)，以4℃ 1，000g離心10min。仔細(xì)收集精漿，分裝標(biāo)記后存放于－70℃冰箱待統(tǒng)一測定。

2.血清制備：按試劑盒說明書留取標(biāo)本，標(biāo)本不可有溶血、乳濁、嚴(yán)重黃疸。采集空腹志愿者靜脈血于自凝管，血液在室溫自然凝固10～20min后，置于 Megafuge 1.0R 離心機(jī)，以2，500r／min離心20min。仔細(xì)收集上清，分裝標(biāo)記后存放于－70℃冰箱待統(tǒng)一測定。

3.精漿及血清Hey濃度的測定：將試劑盒和標(biāo)本平衡至室溫。參照使用說明書，首先將標(biāo)準(zhǔn)品次遞稀釋后加樣，設(shè)空白孔，然后向待測樣品孔逐一加入待測樣品并稀釋，然后經(jīng)過溫育、配液、洗滌、加酶、再溫育、再洗滌、顯色、終止等步驟，最后用酶標(biāo)儀，以450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。應(yīng)用 Curve Expert 1.3軟件，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)樣品的OD值計算得出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)后，最終得出樣品的實(shí)際濃度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

將所得數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行分析處理。先檢驗精漿Hcy濃度、血清Hcy濃度及精液參數(shù)是否為正態(tài)分布。如果為正態(tài)分布則探討精漿Hcy的濃度范圍采用正態(tài)分布法；如果為非正態(tài)分布則探討精漿Hcy的濃度范圍選用百分位數(shù)法。采用Spearman相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精漿Hcy濃度的參考值范圍

經(jīng)正態(tài)性檢驗，精漿和血清Hcy濃度為偏態(tài)分布。采用SPSS 12.0分析得出精漿Hcy幾何平均值為11.02μmol／L，中位數(shù)10.59μmol／L，按百分位數(shù)法分析健康青年男性精漿Hcy濃度的參考值范圍為6.02～21.96μmol／L（95%CI）；血清 Hcy濃度幾何平均值為21.21μmol／L，中位數(shù)10.74μmol／L，參考范圍為7.3～236.45μmol／L（95%CI）（表1）。

表1 精漿及血清Hcy濃度的百分位點(diǎn)

二、精漿Hcy濃度、一次射精精漿Hcy總含量、血清Hcy濃度與精液參數(shù)之間的相關(guān)性分析

經(jīng)正態(tài)性檢驗，血清Hcy濃度及精子活力為偏態(tài)分布，精子濃度、精液量及一次射精精漿中Hcy的總量近似正態(tài)分布。采用Spearman相關(guān)性分析結(jié)果如下（表2）。

表2 精漿Hcy濃度、一次射精精漿Hcy總含量及血清Hcy濃度與精液參數(shù)相關(guān)性

發(fā)現(xiàn)精漿Hcy濃度與精子活力存在顯著負(fù)相關(guān)（圖1），一次射精精漿Hcy總含量與精液量存在顯著正相關(guān)；其余各指標(biāo)之間無顯著相關(guān)性。

圖1 精漿Hcy濃度與精子活力相關(guān)性的散點(diǎn)圖

三、血清Hcy濃度和精漿Hcy濃度的相關(guān)分析

由于血清Hcy濃度和精漿Hcy濃度均為偏態(tài)，所以采用Spearman相關(guān)分析，兩者之間的相關(guān)性結(jié)果（r＝0.101，P＝0.589）顯示不存在顯著相關(guān)性。

討 論

Hcy是體內(nèi)三種含硫氨基酸之一，是甲硫氨酸循環(huán)和半胱氨酸代謝的重要中間產(chǎn)物，其本身并不參加蛋白質(zhì)的合成。Hcy在體內(nèi)主要代謝途徑有三條：（1）Hcy在蛋氨酸合成酶（MS）及輔酶維生素B12參與下，與5－甲基四氫葉酸合成蛋氨酸和四氫葉酸，而5－甲基四氫葉酸是在亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）催化下還原而來；（2）Hcy在胱硫醚－β－合成酶（CBS）及輔酶維生素B6參與下，與絲氨酸縮合成胱硫醚，胱硫醚進(jìn)一步斷裂成胱氨酸和α－酮丁酸；（3）Hcy在細(xì)胞內(nèi)形成后直接釋放到細(xì)胞外液。如果某些環(huán)節(jié)發(fā)生問題就可能引起Hcy的堆積，會導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinaemia），進(jìn)而對機(jī)體產(chǎn)生一系列有害影響。

近些年國外一些研究發(fā)現(xiàn)，生育力低下的男性精漿中Hcy的濃度明顯高于正常男性，同時證實(shí)精液中Hcy水平升高可以損害胚胎的質(zhì)量并引起出生缺陷［6，7］。但是目前國內(nèi)關(guān)于Hcy與男性生育力方面的研究報道還甚少。本研究采用ELISA方法建立了健康青年男性精漿Hcy濃度參考值范圍6.02～21.96μmol／L（95%CI），中位數(shù)10.59μmol／L，為進(jìn)一步的深入研究提供了參考。但是，國外學(xué)者Boxmeer等［8］在研究中采用高效液相色譜法（HPLC）得出70例生育力正常男性精漿Hcy濃度中位數(shù)為4.7μmol／L（1.7～30.4μmol／L）。我們的檢測結(jié)果與國外數(shù)據(jù)比較存在明顯的差異。探求其原因可能與下列因素有關(guān)：（1）測定方法的不同及樣本量的差別可能為出現(xiàn)差異的原因之一；（2）兩者研究對象的種族、飲食結(jié)構(gòu)、生活方式、生活環(huán)境等也是重要的影響因素；（3）由于精漿中蛋白含量很高，粘度大，因此給測量過程中產(chǎn)生困難，產(chǎn)生誤差的概率增加。

本研究發(fā)現(xiàn)精漿Hcy濃度與精子活力存在顯著負(fù)相關(guān)，提示精子活力下降伴隨著精漿Hcy濃度的升高。因此推測，精漿Hcy濃度有可能成為反映精子活力的重要指標(biāo)。精漿Hcy濃度增高可能會對精子產(chǎn)生某種毒害作用，使精子活力降低。除此之外，本研究未發(fā)現(xiàn)精漿Hcy濃度與其他精液參數(shù)存在顯著相關(guān)性。Crha等［9］研究發(fā)現(xiàn)無精子癥患者精漿Hcy水平顯著低于正常人水平，由此可見，精漿中過高或過低的Hcy濃度都可能引起男性生育力降低。有證據(jù)表明，高濃度的Hcy有直接的細(xì)胞毒性，內(nèi)膜的損傷，氧化應(yīng)激物質(zhì)（ROS）的過度產(chǎn)生，轉(zhuǎn)甲基作用受到抑制，基因的異常表達(dá)［10］。但一些研究證明，少量的氧自由基對精子功能和精卵結(jié)合是必要的［11－13］。

本研究顯示，精漿Hcy濃度與血清Hcy濃度無相關(guān)性（r＝0.101，P＝0.589），而且血清 Hcy與精子活力未呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，由此推測可能是精漿中的Hcy直接與精子接觸發(fā)揮毒害作用。但是，Crha等［9］研究卻發(fā)現(xiàn)，正常人血清Hcy濃度與精漿Hcy濃度之間存在顯著正相關(guān)（r＝0.297，P＝0.019）。Boxmeer等［8，14］在兩次研究中，關(guān)于精漿與血清Hcy濃度相關(guān)性卻得出了相反的結(jié)論（r＝0.12，P＝0.41）和（r＝0.16，P＜0.05）。因此，要認(rèn)清兩者之間的相關(guān)性還有待進(jìn)一步深入研究。在下一步的研究中應(yīng)增加樣本的數(shù)量，減小誤差，同時更加注重血液中Hcy與精漿中Hcy相互轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究。本研究還顯示，血清Hcy濃度與精液參數(shù)無顯著相關(guān)性（P＞0.05），與Boxmeer等［14］研究結(jié)果一致。

目前，越來越多的證據(jù)表明Hcy對精子有影響。在生精細(xì)胞的增殖和分化發(fā)育過程中可以在不同的水平被干擾，從而影響到精子發(fā)生過程［15］。精子在成熟過程中細(xì)胞質(zhì)會逐漸減少，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的抗氧化酶體系含量有限并逐漸減少，這會使成熟過程中的精子對氧化自由基的損傷非常脆弱［16］。精液作為精子的微環(huán)境，精漿中包括很多營養(yǎng)物質(zhì)、酶和激素來保證精子正常代謝和精子功能，濃度過低或過高都會對精子功能產(chǎn)生影響。Hcy、葉酸和一碳單位代謝過程互相聯(lián)系，葉酸缺乏和Hcy的堆積會導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥。精漿Hcy增高引起炎癥因子增多，這些炎癥因子會引起精子參數(shù)下降和男性生育力降低。此外，精漿Hcy會使機(jī)體可利用的一氧化氮（NO）減低，NO代謝途徑會影響到陰莖勃起、血睪屏障功能、精子運(yùn)動能力、精子獲能、頂體反應(yīng)和受精［17，18］?？傊邼舛鹊木珴{Hcy可以在精子發(fā)生及成熟后的不同階段產(chǎn)生有害影響，進(jìn)而影響生育力。

體內(nèi)約90%的精漿來源于睪丸以外的附屬腺體組織，而且很可能與輸精管中的液體成分不同，且與在附睪中精子成熟的微環(huán)境亦不同。并且精漿的微環(huán)境與精子發(fā)生的微環(huán)境有著比較大的差別，所以檢測睪丸穿刺組織中的Hcy濃度對研究Hcy對精子發(fā)生及成熟的影響會更有意義。此外，精子內(nèi)Hcy濃度與精漿Hcy濃度、一次射精精漿Hcy的總含量、精液參數(shù)之間的關(guān)系也有待進(jìn)一步研究。這將會更加全面的揭示精漿Hcy濃度變化對男性生育力的影響。

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