李亞芹　臧學(xué)麗　張春雨

摘要：自1985年朱作言教授率先研制出世界上首例轉(zhuǎn)基因魚以來，世界上已經(jīng)有超過35種的魚用于轉(zhuǎn)基因研究，絕大多數(shù)魚類的轉(zhuǎn)基因研究以培育具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的新品系為目的。其中，生長激素轉(zhuǎn)基因魚由于具有生長速度快、餌料轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)而備受關(guān)注。中華鱘是我國珍稀水產(chǎn)動物，具有重要的科研價值和生態(tài)意義，目前尚未得到足夠的關(guān)注，筆者希望利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得具有快速生長的轉(zhuǎn)基因中華鱘龍魚純合子，篩選出優(yōu)良轉(zhuǎn)基因魚新品種。采用顯微注射方法，將帶有黃河鯉MT基因啟動順序與大馬哈魚LGH基因的重組片段導(dǎo)入鱘龍魚受精卵中，通過Northern、Southern雜交方法進(jìn)行檢測，希望可以促進(jìn)鱘龍魚的生長。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)LGH基因；中華鱘龍魚；生長特性；純合子品種

中圖分類號： S965 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.22.0018

目前在轉(zhuǎn)基因魚的研究中，轉(zhuǎn)生長素基因得到了廣泛的認(rèn)知，它改變魚的代謝特征，轉(zhuǎn)移基因表達(dá)往往對受體魚的代謝產(chǎn)生重要影響。例如，加快受體魚的成長和成熟，提高繁殖速率，減少肌肉脂肪含量，改變事物利用效率以及影響能量收支平衡等[1]。

迄今為止，魚類基因的轉(zhuǎn)移研究大多使用生長素基因。生長素基因可以在受體魚中整合與表達(dá)，表達(dá)的生長素基因能夠促進(jìn)多種受體魚的生長。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，基因表達(dá)的生長素基因通過降低代謝能占攝食的比例及提高蛋白質(zhì)的合成能積累，促進(jìn)轉(zhuǎn)生長素基因魚的生長速度，受體魚的肌肉蛋白質(zhì)含量和事物轉(zhuǎn)換效率得到顯著提高。顯然，轉(zhuǎn)生長素基因魚被改變的這些代謝特征，在漁業(yè)生產(chǎn)上有重要的應(yīng)用價值。

鱘魚是我國的名特優(yōu)珍品，肉味鮮美、骨軟、營養(yǎng)價值高，可以制成高鈣食品及國家級名菜，利用轉(zhuǎn)基因手段可以挽救這個瀕臨滅絕的珍貴物種，提高該魚的研究價值和經(jīng)濟(jì)價值，具體設(shè)想如下。

1 材料方法

1.1 基因材料

受體魚（吉林農(nóng)大）；大馬哈魚生長素基因LGH（吉林農(nóng)大）；黃河鯉金屬硫蛋白啟動子MT（吉林農(nóng)大）。

1.2 試劑與酶

探針標(biāo)記試劑盒（Promega公司）；dCTP（北京亞輝公司）；酶類（New Biolabs和華美生物工程公司）；其他試劑（全部為分析純）。

1.3 儀器

手動顯微注射器（CellTram 艾本德中國有限公司），注射針（斜面30G注射針常州市雙馬醫(yī)療器材有限公司）；顯微鏡（LW300LT 上海測維光電技術(shù)有限公司），照相機(jī)（5D Mark II佳能株式會社）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 LGH的啟動區(qū)刪除，MT啟動子的插入

將LGH用EcoRⅠ酶切，用凝膠電泳回收GH基因；將帶有黃河鯉MT基因啟動順序與大馬哈魚LGH 基因順序重組的環(huán)狀基因通過EcoRⅠ酶切，將PGEM312切除，得到6.8Kb的線狀融合基因，即為全魚基因PCMTLGH。

2.2 受精卵采集、基因?qū)?/p>

采集鱘龍魚受精卵，在10月中下旬中華鱘繁殖季節(jié)，對健康的親魚進(jìn)行人工催產(chǎn)，采集精卵5℃條件下存放，每次取適當(dāng)精、卵進(jìn)行受精，在受精10分鐘后至第一次卵裂前，將約10微克全魚基因顯微注射到受精卵核附近區(qū)。

2.3 魚苗培養(yǎng)

將注射外源基因的受精卵置于20℃水溫箱中，3～4天可孵化出魚苗。待魚苗平游后將其放在網(wǎng)箱中投喂活餌料飼養(yǎng)，長到約2厘米左右放入有防逃措施的魚池中飼養(yǎng)至轉(zhuǎn)基因魚苗，同時對照魚放在飼養(yǎng)條件相同的另一池塘飼養(yǎng)。第二年春經(jīng)標(biāo)記與對照魚放在池塘對照飼養(yǎng)。

2.4 探針制備

將全魚基因用EcoRⅠ酶切，電泳回收6.8左右的DNA條帶。純化后用放射性同位素標(biāo)記。

2.5 分子雜交

一是DNA檢測。待魚苗成長后，隨機(jī)捕獲，剪魚鰭條并做標(biāo)記，提取DNA，每個DNA樣品均為5微克，將總DNA樣品點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜上進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，再將斑點(diǎn)雜交呈陽性的DNA樣品，取10微克經(jīng)限制性酶切后，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行Southern印記雜交；二是RNA檢測和Nortnern雜交。

3 預(yù)期結(jié)果

3.1 轉(zhuǎn)大馬哈魚LGH外源基因的獲得

將pUcMT與pGEMGH1進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、篩選，獲取轉(zhuǎn)LGH外源基因pcMTLGH。

3.2 DNA分子雜交

3.2.1 斑點(diǎn)雜交 隨機(jī)選取10尾注射過外源基因的中華鱘龍魚進(jìn)行Southern雜交。

3.2.2 Northern雜交 抽取4尾Southern印跡雜交呈陽性的RNA樣本進(jìn)行Northern印跡雜交，預(yù)期陽性全魚基因整合后25%發(fā)生轉(zhuǎn)錄。

3.3 外源基因在受體魚中的表達(dá)

在DNA雜交陽性的魚中，檢測出生長激素基因，表明外源基因在轉(zhuǎn)基因鱘龍魚中具有合成生長激素的能力。

3.4 轉(zhuǎn)基因鱘龍魚的預(yù)期體重

在生長條件相同的情況下，如果轉(zhuǎn)LGH基因鱘龍魚的體重是對照魚體重的1.5倍以上，說明外源生長激素基因在鱘龍魚體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，具有顯著的促進(jìn)生長作用；鱘龍魚血清中的生長激素基因濃度可以反映轉(zhuǎn)LGH外源基因在鱘龍魚中的表達(dá)水平。

轉(zhuǎn)LGH基因技術(shù)快速發(fā)展的同時也帶來一些需要解決的問題，如受精卵體外操作成活率低，外源基因的整合位點(diǎn)及拷貝數(shù)不能控制，表達(dá)不能和預(yù)期結(jié)果相符，外源基因插入容易缺失突變至不育等[2]。只有在認(rèn)真研究這些問題的基礎(chǔ)上，才能自如地導(dǎo)入目的基因，希望該設(shè)想對轉(zhuǎn)基因鱘龍魚的研究能起到推動作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱文進(jìn)，張美俊.動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究領(lǐng)域及其對社會的影響[J]動物科學(xué)，2005，4：8-10.

[2] 張希春.轉(zhuǎn)基因魚的食用安全性評價及其分子生物學(xué)基礎(chǔ)[J].衛(wèi)生研究，2004，（02）.

作者簡介：李亞芹，碩士，長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，副教授，研究方向：基因工程。