賈宏昉，陳紅麗，黃化剛，楊永霞，崔紅，劉國順

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院、國家煙草栽培生理生化基地，河南省鄭州市文化路95號 450002；2 貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州省畢節(jié)市天河路116號 551700

施用腐熟秸稈肥對烤煙成熟期碳代謝途徑影響的初報(bào)

賈宏昉1，陳紅麗1，黃化剛2，楊永霞1，崔紅1，劉國順1

1河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院、國家煙草栽培生理生化基地，河南省鄭州市文化路95號 450002；2 貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州省畢節(jié)市天河路116號 551700

為了探明土壤添加腐熟秸稈對成熟期烤煙中部煙葉淀粉代謝途徑的影響，明確獲取優(yōu)質(zhì)煙葉的最佳施用量。本試驗(yàn)以烤煙品種NC89為試材，設(shè)置添加腐熟秸稈0 g/盆、80 g/盆和160 g/盆3個處理，研究不同量腐熟秸稈對成熟期烤煙淀粉積累、碳代謝相關(guān)酶活及關(guān)鍵基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明：在烤煙發(fā)育成熟期，土壤添加不同量腐熟秸稈對中部葉還原糖、總糖及淀粉含量影響顯著。土壤添加腐熟秸稈均可提高淀粉酶的活性，但是對轉(zhuǎn)化酶影響不大；對碳代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)分析表明添加腐熟秸稈增加了蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（SUT1）、焦磷酸化酶基因（AGPase）和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因（GBSSI）等關(guān)鍵基因的表達(dá)，從而促進(jìn)成熟期煙葉碳代謝途徑的進(jìn)行，有利于提高煙葉的品質(zhì)；其中每盆添加80 g腐熟秸稈取得的效果最好。

煙草；腐熟秸稈；碳代謝；成熟期

土壤的營養(yǎng)狀態(tài)是影響植物生長發(fā)育的重要因子，對烤煙葉片淀粉的積累有顯著影響。烤煙的品質(zhì)與淀粉含量密切相關(guān)，煙草中淀粉的分解、轉(zhuǎn)化、消耗和積累決定著煙葉內(nèi)在品質(zhì)和外觀商品等級的優(yōu)劣[1-2]。我國煙葉中淀粉含量約為4%～6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國外優(yōu)質(zhì)烤煙的淀粉含量（1%～2%）[3]。淀粉含量高已經(jīng)成為制約我國煙葉質(zhì)量提高的一個重要因素。碳代謝途徑是淀粉積累分解的重要環(huán)節(jié)，探討烤煙淀粉積累及其組分的變化機(jī)理對改善烤煙品質(zhì)具有重要價值。淀粉是碳代謝途徑產(chǎn)物的重要形式，烤煙葉片中的碳代謝產(chǎn)物主要分為總糖、還原糖和淀粉，這三種物質(zhì)的含量對烤煙品質(zhì)的影響很大。與碳代謝密切相關(guān)的基因有蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（SUT1）、蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGPase）和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因（GBSSI）等[4-6]。前人在水稻、小麥、大豆等作物上研究表明，葉片總糖、還原糖和淀粉含量與碳代謝相關(guān)酶或基因之間存在密切關(guān)系[4-6]。碳代謝相關(guān)基因或酶活對土壤營養(yǎng)條件是敏感型的[7-8]，可利用改善土壤營養(yǎng)條件進(jìn)行有效的調(diào)控，以達(dá)到提高煙葉品質(zhì)的目的。目前關(guān)于煙葉淀粉積累及相關(guān)碳代謝酶活及基因變化的研究很少，大多集中在生態(tài)環(huán)境方面，對土壤腐熟秸稈營養(yǎng)效應(yīng)相關(guān)的機(jī)理研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)研究不同量腐熟秸稈對烤煙成熟期淀粉積累及相關(guān)基因表達(dá)的影響，旨在探索成熟期煙葉淀粉積累的機(jī)理，明確獲取優(yōu)質(zhì)煙葉的合適腐熟秸稈添加量，為進(jìn)一步調(diào)控?zé)熑~淀粉積累、提高煙葉品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試烤煙品種為NC89，品種由北方煙草育種中心提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理

盆栽試驗(yàn)于2012年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)進(jìn)行，供試土壤為河南省許昌市許昌校區(qū)的耕作層土壤，土壤類型為黃褐土，質(zhì)地為壤土；土壤有機(jī)質(zhì)含量 12.10 g·kg-1，堿解氮含量 50.20 mg·kg-1，速效鉀含量 130.70 mg·kg-1，速效磷含量 7.80 mg·kg-1，pH為8.05。

供試秸稈為人工發(fā)酵后的小麥秸稈，秸稈的人工發(fā)酵方法為：供試秸稈采自河南襄縣2011年收獲的小麥秸稈，采用人工切割成長度10 cm左右，人工調(diào)節(jié)秸稈含水量保持在60%～70 %，然后采取堆垛發(fā)酵，堆垛時采取一層秸稈（15 cm）+ 3 cm的土+經(jīng)過處理的腐熟劑（腐熟劑與土混勻，增加腐熟劑的均勻度），堆垛高度為120 cm，發(fā)酵過程中每隔10天進(jìn)行1次翻垛處理。當(dāng)秸稈顏色變黑，同時用手一拉，成拉絲狀斷裂時，為完全腐熟狀態(tài)。腐熟劑為鶴壁恒隆態(tài)生物科技有限公司生產(chǎn)的HM高效腐熟劑。發(fā)酵時間從2012年3月5日開始，4月15日發(fā)酵結(jié)束。腐熟后小麥秸稈全碳含量為19.48 %，全氮含量為0.598 %，C/N為32.6。

試驗(yàn)用盆規(guī)格為45×50 cm（直徑×深度），試驗(yàn)設(shè)3個秸稈用量水平CK（0 g/盆）、T1（80 g/盆）和T2（160 g/盆），其中T1折算大田試驗(yàn)秸稈用量300 kg/畝，T2折算大田試驗(yàn)秸稈用量600 kg/畝。秸稈稱重前采用鼓風(fēng)干燥箱在40 ℃條件烘干3 h，相對含水量4.5 %。盆栽用土經(jīng)自然風(fēng)干后過0.5 cm×1 cm網(wǎng)篩備用，每盆裝土20 kg。在移栽前一周將秸稈、土壤和肥料混勻后裝盆，均勻澆水至土壤相對含水率在90%左右。每個處理30盆，隨機(jī)排列，共計(jì)90盆。試驗(yàn)于2012年5月5日移栽，純氮用量3 g·pot-1，N:P2O5:K2O=1:1.5:3。

1.3 樣品采集

采集中部葉（10～12葉位），移栽后60 d取第1次樣品，此時煙葉處于旺長后期，第1次取樣后第2天安排打頂，即移栽后61 d開始打頂，隨后在移栽后75 d和90 d各取1次樣品，整個試驗(yàn)過程共取樣3次，其中移栽后90 d時中部煙葉已到成熟采收期。選擇5株長勢一致的煙株，每株取1片煙葉，混合取樣。每個時期3個重復(fù)。迅速置于液氮中，于-80℃冰箱凍存，用于基因表達(dá)研究和酶活分析；同時取組織樣品，用于煙葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析?？竞髽舆€原糖、總糖和淀粉含量的測定選取密集烤房三段式烘烤工藝烘烤后的C3F作為測試樣品。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 淀粉粒觀察[9]

選取生長發(fā)育良好的中部葉1 mm～3 mm，采用5 %戊二醛溶液固定，于冰箱內(nèi)4℃保存。采用透射電鏡觀察淀粉粒超微結(jié)構(gòu)，并拍照。

1.4.2 酶活性測定

將0.2 g葉片放入8 mL 1%的NaCl中研磨為勻漿后 3000 r/min 離心10 min，參照 Xue 等[10]的方法測定轉(zhuǎn)化酶活性；參照 Doehlert 等[11]的方法等測定淀粉酶活性。

1.4.3 還原糖、總糖和淀粉含量測定[12]

取新鮮煙葉，去主脈，在105 ℃烘箱中烘烤15 min，60℃下烘烤2～3 h至煙葉到恒重。采用德國seal AA流動分析儀測定含量；其中還原糖和總糖為烤后樣。

1.4.4 基因表達(dá)分析

選取生長發(fā)育良好的中部葉，每次取樣將來源于不同煙株的5片葉混合以減少試驗(yàn)誤差，所取葉片迅速置于液氮中冷凍保存。采用Trizol法提取煙草總RNA,樣品通過隨機(jī)引物法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)Genbank發(fā)布的蔗糖合成酶基因（SS）、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（SUT1）、蔗糖轉(zhuǎn)化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGPase）、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因（GBSSI）和內(nèi)參基因（L25）的序列設(shè)計(jì)各基因擴(kuò)增引物，進(jìn)行RT-PCR。

表1 煙草碳代謝途徑關(guān)鍵基因RT-PCR引物序列Tab. 1 RT-PCR primer sequences of tobacco carbohydrate metabolism

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Sigmplot10.0和SPSS 12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同量腐熟秸稈對移栽后90 d中部葉片細(xì)胞淀粉粒積累的影響

圖1 移栽后90 d煙草中部葉片葉綠體內(nèi)淀粉粒超微結(jié)構(gòu)觀察（×1000）Fig. 1 Ultrastructure of starch grains in chloroplast of middle leaf tobacco 90 days after transplanting

在煙株生長過程中，對中部葉位移栽后90 d的葉片取樣，進(jìn)行細(xì)胞超微觀察，比較3個土壤狀態(tài)下葉片采收時淀粉粒的積累和降解情況。結(jié)果如圖1所示：由圖1可以看出，3個處理中部葉片細(xì)胞均開始降解，淀粉粒顆粒數(shù)量多且體積大，分散在胞質(zhì)中，形狀、結(jié)構(gòu)不規(guī)則；葉綠體被膜及葉綠體類囊體片層間分布有一些高電子密度嗜鋨物質(zhì)。3個處理相比，T1和T2處理相對于CK處理淀粉降解較充分，嗜鋨顆粒數(shù)目明顯較多。

2.2 不同量腐熟秸稈對成熟期烤煙中部葉碳代謝關(guān)鍵物質(zhì)的影響

對添加不同量腐熟秸稈下葉片發(fā)育過程中的淀粉含量進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。成熟期煙葉淀粉含量處于上升趨勢，在移栽后60 d 時T1和T2處理含量均顯著高于對照CK，數(shù)據(jù)分析顯示達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。移栽后60 d對照CK淀粉含量迅速增加，T1和T2處理增加相對緩慢，在移栽后75 d和90 d時兩個處理均低于對照CK，烘烤后煙葉也低于對照，這可能與成熟期淀粉的降解有關(guān)。本研究對3個處理烤后樣品進(jìn)行分析，烤后樣T1和T2處理淀粉含量仍顯著低于對照（P＜0.05），但是總糖和還原糖卻顯著高于對照CK（P＜0.05），尤其是總糖比對照提高了12.98%～23.93 %。

表2 不同量腐熟秸稈處理中成熟期烤煙中部葉還原糖、總糖和淀粉的含量（殺青樣和烤后樣）Tab. 2 Content of reducing sugar, total sugar and starch in middle leaf tobacco under different application rates of rotten straw(samples after deactivation of enzymes and samples flue-cured)

2.3 不同量腐熟秸稈對成熟期烤煙中部葉碳代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

圖2 不同量腐熟秸稈處理中成熟期烤煙中部葉碳代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)分析Fig. 2 Expression analysis of key genes in the carbohydrate metabolism of middle leaf tobacco under different application rates of rotten straw

為了檢測不同量腐熟秸稈對成熟期烤煙中部葉碳代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，本試驗(yàn)利用RT-PC技術(shù)對蔗糖合酶基因（SS）、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（SUT1）、轉(zhuǎn)化酶基因（INV）、焦磷酸化酶基因（AGPase）和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因（GBSSI）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析，結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯鰺熑~移栽后60 d到90 d這段時期碳代謝途徑關(guān)鍵基因SS、SUT1、INV、AGPase和GBSS I均出現(xiàn)一個先增加后降低的趨勢。對3個處理進(jìn)行基因表達(dá)比較發(fā)現(xiàn)T1和T2處理碳代謝關(guān)鍵基因除轉(zhuǎn)化酶基因（INV）外，其余基因表達(dá)均顯著高于對照（CK），尤其是在煙葉移栽后75 d時T1處理GBSSI和AGPase基因表達(dá)顯著高于T2和對照（CK）。這表明添加不同量腐熟秸稈可以增加成熟期煙葉的淀粉合成代謝能力。

2.4 不同量腐熟秸稈對成熟期烤煙中部葉碳代謝關(guān)鍵酶活性的影響

在煙葉成熟期中部葉片發(fā)育過程中，對碳代謝關(guān)鍵酶蔗糖轉(zhuǎn)化酶和淀粉酶活性進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖3所示：由圖3A可以看出淀粉酶活性變化在3個處理中均呈單峰曲線，整體趨勢一致。隨著葉片發(fā)育淀粉酶活性逐漸上升，在移栽后75 d時達(dá)到最大值，隨后迅速降低。T1和T2處理淀粉酶活性在移栽后60 d時略低于對照（CK），而在移栽60 d以后顯著高于對照（CK）。這表明T1和T2處理成熟期淀粉降解速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照（CK）。由圖3B可以看出轉(zhuǎn)化酶活性在成熟期3個處理中均呈單峰曲線，但3個處理之間差異不顯著，這和本研究檢測的轉(zhuǎn)化酶基因表達(dá)結(jié)果相一致（圖2）。

圖3 不同量腐熟秸稈處理中成熟期烤煙中部葉碳代謝關(guān)鍵酶的活性Fig. 3 Activity of key enzyme in carbohydrate metabolism of middle leaf tobacco under different application rates of rotten straw

3 討論

植物碳水化合物的生物合成受到多因素的影響。大量的研究表明煙草葉片碳水化合物的含量也受到光照、溫度 、干旱、海拔高度等生態(tài)環(huán)境因素的影響[13-15]。本研究對田間不同量腐熟秸稈下煙草植株成熟期中部葉蔗糖與淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)水平、酶活性、總糖含量、還原糖及淀粉含量進(jìn)行研究分析。發(fā)現(xiàn)土壤添加腐熟秸稈有利于成熟期煙葉碳代謝途徑的進(jìn)行，降低了烤后煙葉的淀粉含量，增加了總糖和還原糖含量，對提高煙葉品質(zhì)具有重要意義。

蔗糖是高等植物光合產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)闹饕问? 經(jīng)韌皮部運(yùn)輸?shù)叫枰茉春吞荚吹慕M織細(xì)胞, 為細(xì)胞生長發(fā)育提供能源和碳源，在這個過程中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起關(guān)鍵作用。石永春等[16]研究表明，低溫增加了煙草葉片SUT的表達(dá)量，有利于煙葉中蔗糖的積累。Burkle等[17]通過抑制煙草的 SUT表達(dá)而導(dǎo)致維管束中蔗糖含量降低，開花延遲。本研究表明通過土壤添加不同量腐熟秸稈可以增加蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，這預(yù)示著添加腐熟秸稈可能增強(qiáng)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，從而有利于葉片盡量轉(zhuǎn)運(yùn)蔗糖，以滿足各種代謝的需求，這和本試驗(yàn)檢測到最終T1和T2處理烤煙中總糖和還原糖比對照顯著增加相一致。

對植物體內(nèi)淀粉合成代謝的研究表明，蔗糖合成酶（SS）和轉(zhuǎn)化酶（INV）都具有催化蔗糖降解功能。蔗糖和淀粉的代謝緊密相關(guān)，SS主要調(diào)節(jié)蔗糖的降解，為淀粉合成提供底物，其活性的高低與淀粉積累量相一致[18]；而轉(zhuǎn)化酶（INV）被認(rèn)為是控制淀粉合成的關(guān)鍵酶[17]；另外，焦磷酸化酶（AGPase）為淀粉生物合成的限速酶，該酶活性的大小決定淀粉合成的速率和最終合成量的多寡[20-21]；因此，這3個基因的表達(dá)及酶活性大小意味著功能葉片中內(nèi)含物積累的狀況。本研究發(fā)現(xiàn)T1和T2處理均顯著增加了蔗糖合成酶（SS）基因和焦磷酸化酶基因（AGPase）的表達(dá)活性，而轉(zhuǎn)化酶基因（INV）表達(dá)變化差異不大，這和本試驗(yàn)測定的轉(zhuǎn)化酶活性結(jié)果相一致，推測添加腐熟秸稈對成熟期葉片淀粉代謝途徑的影響可能主要依賴于蔗糖合成酶（SS）和焦磷酸化酶（AGPase）；雖然T1和T2處理增加了淀粉合成的能力，但是由于這兩個處理中淀粉酶活性也增強(qiáng)了，推測其分解淀粉的速度可能大于其合成速度，所以導(dǎo)致最終本研究檢測到的葉片淀粉含量仍低于對照CK，這和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果相一致。

另外，本研究對顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因（GBSSI）的表達(dá)進(jìn)行了檢測，表明T1處理的GBSSI基因表達(dá)量在成熟后期顯著高于T2和CK，GBSSI作為顆粒結(jié)合型淀粉合成酶，緊密結(jié)合在淀粉粒上，通過 a-1,4-D-糖苷鍵將ADPG中的葡萄糖殘基加到引物的非還原端，形成線性大分子[12]。GBSSI在T1處理煙葉中的活躍表達(dá)，說明T1處理煙葉中直鏈淀粉含量可能較高。但是直鏈淀粉含量的差異是否是T1處理成熟期煙葉淀粉含量顯著低于對照CK的原因還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié)論

土壤添加腐熟秸稈有利于成熟期煙葉碳代謝，從而提高了煙葉的品質(zhì)。至于土壤添加腐熟秸稈是通過增加土壤養(yǎng)分或通過改變土壤的物理和化學(xué)性狀（土壤的pH、容重、持水特性等）來改變碳代謝相關(guān)基因和酶活的變化還需要進(jìn)一步的深入研究來證實(shí)，這也是本研究下一步工作的重點(diǎn)。

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Preliminary report on effect of applying rotten straw fertilizer on carbon metabolism in maturing flue-cured tobacco

JIA Hongfang1, CHEN Hongli1, HUANG Huagang2, YANG Yongxia1, CUI Hong1，LIU Guoshun1
1 College of Tobacco Science, Henan Agricultural University; National Tobacco Cultivation, Physiology and Biochemistry Research Centre, Zhengzhou 450002, Henan, China；2 Bijie Municipal Tobacco Company, Bijie 551700, Guizhou, China

Tobacco variety NC 89 was sampled to investigate effect of applying rotten straw fertilizer on starch accumulation, enzymes activity of carbohydrate metabolism and expression of key genes in maturing flue-cured tobacco. Results showed that application of rotten straw fertilizer added in soil had significant impact on content of reducing sugar, total sugar and starch in middle tobacco leaves. It increased amylase activities while exerted little impact on invertase activities. It also increased expression level of starch biosynthesis-related genes and enzymatic activity ofSS, SUT1, AGPase, andGBSSI, thereby carbohydrate metabolism was facilitated.

tobacco; rotten straw fertilizer; carbohydrate metabolism

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.010

S572.06 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）04-0048-05

中國煙草總公司特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項(xiàng)濃香型項(xiàng)目（110201101001 Ts-01）

賈宏昉（1982—），博士，講師，主要從事植物營養(yǎng)分子遺傳方面的研究，Email: jiahongfang@126.com

劉國順（1954—），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事煙草生理生化方面研究，Email: liugsh1851@163.com

2013-09-24