付強，鄒頡，張吉順，王軼，任學(xué)良

貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴州省貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路 550081

生物技術(shù)

基于毛細(xì)管電泳的TILLING實驗技術(shù)的建立

付強，鄒頡，張吉順，王軼，任學(xué)良

貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)分子遺傳重點實驗室，貴州省貴陽市觀山湖區(qū)龍灘壩路 550081

CEL I內(nèi)切酶特異識別并切斷錯配堿基，是建立TILLING實驗技術(shù)平臺的關(guān)鍵之一。本文從貴州省貴陽市當(dāng)?shù)胤N植的西芹中獲得CEL I酶粗提物，利用一對具有已知單堿基差異的質(zhì)粒作為底物驗證所提CEL I酶粗提物的酶切活性，通過瓊脂糖電泳和毛細(xì)管電泳對酶切產(chǎn)物進行檢測，表明所獲芹菜粗提物具有CEL I活性。本實驗建立了適宜煙草TILLING實驗的CEL I粗提物酶切體系：酶切溫度42℃， 酶切時間 60 min，酶切反應(yīng)總體積15 μL，包括8 μL PCR 產(chǎn)物、4.5 μL ddH2O、1.5 μL 酶切緩沖液(pH 7.5, 500 mmol/ L KCL, 100 mmol / L Tris-Cl, 15 mmol / L MgCl2)和1 μL CEL I酶（稀釋為原始粗提液0.05倍）。

TILLING；芹菜CEL I核酸酶；ABI遺傳分析儀；毛細(xì)管電泳

Targeting Induced Local Lesions IN Genomes(TILLING)是由美國癌癥研究中心的Steven Henikoff科研團隊2001年發(fā)展起來的定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)，是一種在化學(xué)誘變和PCR定向篩選基礎(chǔ)上檢測點突變的反向遺傳學(xué)研究方法。

TILLING的基本實驗流程是：采用特異基因引物對應(yīng)用化學(xué)誘變劑所產(chǎn)生的突變?nèi)后w進行PCR來放大突變信號，經(jīng)變性和緩慢降溫復(fù)性獲得異源DNA雙鏈，采用具有特異切割錯配位點的核酸內(nèi)切酶切割異源雙鏈，再通過電泳技術(shù)檢測突變位點，最后通過測序確認(rèn)并篩選出目的基因突變體。該技術(shù)具有通量高、操作簡單、成本低等優(yōu)點，此方法在功能基因組研究中扮演著重要角色。 TILLING技術(shù)在育種應(yīng)用中具有三個主要優(yōu)點：(1) 在構(gòu)建突變?nèi)后w過程中會產(chǎn)生大量的遺傳突變表型，包括低表現(xiàn)量，高表現(xiàn)量的突變。(2)TILLING實驗過程中產(chǎn)生的突變是穩(wěn)定的可遺傳突變。(3)TILLING技術(shù)可應(yīng)用于多倍體生物以及功能冗余基因。目前，該技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于水稻[1]、小麥[2]、大麥[3]以及番茄[4]等多種經(jīng)濟作物。

影響TILLING實驗結(jié)果的關(guān)鍵之一是CEL I酶的獲取，該酶是從芹菜中提取的一種核酸內(nèi)切酶，能夠高效特異識別和切割錯配堿基[5-6]。商用CEL I酶價格昂貴，不利于大規(guī)模的TILLING分析實驗。影響TILLING實驗效果的另一關(guān)鍵因素是酶切片段的檢測，常用的瓊脂糖電泳的分辨率往往較低，而采用引物熒光標(biāo)記的聚丙烯酰胺凝膠毛細(xì)管電泳能夠獲得高分辨率的定量結(jié)果，并且能夠確定突變位點。

本文從芹菜中提取了CEL I酶，并進行了活性檢測，建立了適宜煙草TILLING實驗的酶切體系，可用于煙草定向遺傳改良及功能基因組研究。

1 材料和方法

1.1 材料

CEL I酶原料：市購西芹。PCR相關(guān)試劑及瓊脂糖電泳試劑均購自TAKARA。毛細(xì)管電泳試劑均購自英濰捷基，實驗過程使用的化學(xué)試劑等級為分析純。PCR擴增模板和引物都由英濰捷基公司合成。具有一個堿基差異的序列作為PCR 擴增模板[7]；

ZYD:GGTATAGTATGATTGCTGAT GCAGAAGAGAG…167bp…G…227bp…GGGACTTATCACACCTGG

BG:GGTATAGTATGATTGCTGATG CAGAAGAGAG…167bp…C…227bp…GGGACTTATCACACCTGG

實驗設(shè)備主要包括ABI 3500遺傳分析儀（ABI,USA）；PCR儀（ABI, USA）；電泳儀（BIORAD,USA）；HimacCF16RX型高速冷凍離心機（Hitachi,Japan）；純水儀（MILLIPORE,USA）；孵育箱。

1.2 方法

1.2.1 芹菜中CEL I的粗提

CEL I內(nèi)切酶的提取參照 Till 等[6]的方法，所有操作均在 4 ℃進行。取500 g芹菜莖部，用冷的ddH2O仔細(xì)清洗，然后擦干芹菜上的水滴，將芹菜剪成5～6 cm長，放入榨汁機得到的勻漿，經(jīng)濾紙過濾后3100 rpm離心20 min，將上清轉(zhuǎn)入新離心管。

在500 mL上清液中加入Tris和PMSF，使其終濃度分別為0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.7和100 μmol/L PMSF。向上清液中加入12.5 g硫酸銨，溶液終濃度為 25%，攪拌30 min，9000 rpm離心50 min，收集到400 mL上清，再32 g加入固體硫酸銨，使上清液中硫酸銨最后濃度達(dá)到80%，緩慢攪拌30 min后9000 rpm離心70 min，輕輕倒棄上清溶液，保留沉淀，懸浮于50 mL的0.1 mol/L Tris-HCl pH 7.7, 0.5 mol/L KCl和 100 μmol/L PMSF緩沖液中，確保全部沉淀都溶解。把重懸的蛋白溶液加入到透析袋（cutoff:10000 Da）中置于Tris-HCl pH 7.7, 0.5 mol/L KCl和100 μmol/L PMSF透析緩沖液中進行透析，每小時換一次透析緩沖液，8小時透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶液倒入干凈的離心管，分裝后在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR 擴增及雜合雙鏈的形成

采用 Primer Premier 5軟件設(shè)計引物對ZYD和BG質(zhì)粒中含有單堿基差異的區(qū)段進行擴增，正向引物5’進行6-FAM標(biāo)記，序列為5’-TCCTGTTCCTCAAGTC AAGC-3’， 反 向 引 物 5’進 行 HEX標(biāo) 記， 序 列5’-TCAGAACCAACTCAGCTCCA-3’。

PCR 采用 20 μL 反應(yīng)體系，14.9 μL ddH2O，2 μL 10倍PCR緩沖液，1.6 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.5 μL ZYD，0.5 μL BG, 正反引物均為 0.2 μL (10 μmol/L )，ExTaq酶為0.1 μL。在ABI Veriti PCR儀進行擴增，擴增程序如下：預(yù)變性 94 ℃ 5 min，2個擴增循環(huán)（94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），2個擴增循環(huán)（94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s），31 個擴增循環(huán)（94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）延伸 72 ℃ 10 min。然后進行錯配化，首先進行95 ℃退火10 min迅速變性，72 ℃ 20 s，每個循環(huán)降低 0.3℃直至 20 ℃，最終緩慢變性，形成錯配雜合雙鏈。

1.2.3 酶切孵育時間對酶切的影響

采用15 μL酶切反應(yīng)體系，含1.5 μL CEL I酶切緩沖液(pH 7.5, 500 mmol/ L KCL, 100 mmol / L Tris-Cl, 15 mmol / L MgCl2)、1 μL稀釋2倍的CEL I 粗提物、8 μL經(jīng)PCR產(chǎn)物錯配形成的異質(zhì)雙鏈DNA，用Millipore水補齊到15 μL。在42℃下孵育10 min，30 min，60 min，120 min，300 min，加入 3 μL 0.15 mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA) 終止反應(yīng)。

1.2.4 酶濃度對ABI 3500檢測的影響

采用15 μL酶切反應(yīng)體系，含1.5 μL CEL I緩沖液、1 μL的CELI 粗提物（稀釋為原始粗提液的0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.5），8 μL 經(jīng)PCR產(chǎn)物錯配形成的異質(zhì)雙鏈DNA，用Millipore水補齊到15 μL。在42℃下孵育25 min，加入3 μL，0.15mol/L的乙二胺四乙酸(EDTA) 終止反應(yīng)。

1.2.5 電泳分析

經(jīng)CEL I粗提物酶切后的產(chǎn)物使用含有3 μL GoldView ‖型核酸染色劑的3% 瓊脂凝膠電泳檢測。電極緩沖液采用1×TAE，150 V 穩(wěn)壓電泳30 min，利用BioRad 成像系統(tǒng)觀察、分子量標(biāo)記采用寶生物工程公司的DL 2000 DNA MARKER。在ABI3500遺傳分析儀上利用變性聚丙稀酰胺凝膠進行電泳檢測及相關(guān)Genescan軟件分析，上樣混合液為10 μL，包含0.5 μL酶切產(chǎn)物，0.5 μL購自ABI公司的LIZ1200分子量內(nèi)標(biāo)以及9 μL HiDi。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶切孵育時間對酶切的影響

CEL I 酶的主要特性是其可以對含有堿基錯配的DNA雙鏈在堿基錯配處進行準(zhǔn)確特異的切割，CEL I 內(nèi)切酶粗提物的提取參考Till 等[6]的方法。本實驗中利用貴州省貴陽市當(dāng)?shù)氐那鄄俗鳛樵咸崛EL I酶，為此，實驗首先利用具有單堿基差異的質(zhì)粒作為模板，按1:1比例混合，檢測粗提液中CEL I酶的活性。

為了驗證 CEL I 的內(nèi)切酶活性，本實驗測試了酶切時間和CEL I 粗提產(chǎn)物的用量等酶切體系組分對CEL I 酶切效果的影響。我們將緩慢變性退火后8 μL的ZYD-PCR 產(chǎn)物作為底物，加入1.5 μL的酶切緩沖液和1 μL稀釋2倍的CEL I 粗提物，最后加入4.5 μL的ddH2O在42 ℃下進行酶切，酶切時間梯度設(shè)定為10 min，30 min，60 min，120 min，300 min。不同的酶切孵育時間對錯配的切割效果見圖1，在所有經(jīng)過CELI酶處理的電泳道中都新出現(xiàn)2條帶，大小分別為 225 bp和173 bp ,與已知發(fā)生G-C 點突變的位置完全吻合。這個結(jié)果表明說明異質(zhì)雙鏈體中的錯配堿基可被 CEL I 粗提物有效識別和切割。不同酶切孵育時間的效果有所不同。經(jīng)過10 min 的酶切就能獲得模糊的酶切特征條帶，隨著酶切時間的延長，酶切特征條帶逐漸清晰，在60 min時，酶切特征條帶最為清晰，但是酶切60 min之后，酶切特征條帶信號沒有明顯增強，并且泳道背景信號也逐漸放大。因此，酶切時間在45到60 min 較為合適。

圖1 CEL I活性檢測及酶切時間對酶切結(jié)果的影響Fig. 1 The identification of CEL I activity and the effect of incubation time on digestion results

2.2 酶濃度對瓊脂糖電泳檢測的影響

盡管瓊脂糖電泳具有快速，便捷和花費低等優(yōu)點，但是其分辨率低和靈敏度不高，不能有效檢測具有突變位點的DNA片段。為此，我們利用ABI3500遺傳分析儀，借助內(nèi)標(biāo)LIZ1200 以及利用相關(guān)Genescan分析軟件對ZYD上突變位點進行準(zhǔn)確的切割位點定位。在預(yù)實驗中，稀釋2倍的CEL I粗提液對標(biāo)記在引物上的6-FAM和HEX熒光標(biāo)記可能具有活性，能夠?qū)⑵鋸腄NA片段上的切除，導(dǎo)致ABI 3500 遺傳儀在398bp的位置上檢測不到熒光信號（未發(fā)表的數(shù)據(jù)）。

因此，在15 μL切割反應(yīng)體系中，采用梯度濃度（稀釋為原始初提液的0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.5）的 CEL I粗提液以確定適合ABI 3500 遺傳分析儀檢測的CEL I酶粗提液濃度。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)CEL I粗提液稀釋到原始初提液的0.25時，從瓊脂糖電泳圖中可以檢測到酶切特征條帶，隨著酶濃度的升高，底物條帶(含異質(zhì)雙鏈的條帶)信號進一步減弱 ,而切割產(chǎn)生的新條帶信號則增強。當(dāng)CEL I酶粗提液酶稀釋倍數(shù)大于4倍時，酶切產(chǎn)生的酶切特征條帶在瓊脂糖電泳不能被檢測。

圖2 不同稀釋倍數(shù)CELI粗提液對錯配切割效果的影響Fig. 2 Effect of CEL I crude extraction with different diluted concentration on mismatch cleavage

2.3 酶濃度對ABI 3500檢測的影響

利用ABI 3500遺傳分析儀對上述9個CEL I酶濃度酶切后的DNA片段進行分析，從圖3中可以看出，用0.05倍CEL I粗提液酶切產(chǎn)生的酶切特征片段的峰值是最大的，隨著酶切濃度的提高，底物條帶的峰值急劇下降，但是酶切特征片段的峰值也降低。

綜合以上結(jié)果，結(jié)合各實驗因素實際應(yīng)用時的需要，建立了有效的酶切體系：酶切溫度42 ℃， 酶切時間 60 min，酶切反應(yīng)總體積15 μL，包括8 μL PCR產(chǎn)物、4.5 μL ddH2O、1.5 μL 酶切緩沖液和 1 μL CEL I酶（稀釋為原始粗提液0.05倍）。

圖3 不同濃度的CELI粗提液的酶切效果Fig. 3 Effect of mismatch cleavage of CEL I crude extraction by ABI 3500 genetic analyzer

3 討論

在過去的十年，水稻，大豆，草莓，煙草等農(nóng)作物完成大規(guī)模的基因組測序，產(chǎn)生了大量的核酸序列信息[8-10]。將特定基因的序列信息與表型相聯(lián)系是遺傳學(xué)研究的重要實驗手段，也是研究功能基因組的方法之一。TILLING實驗過程中的關(guān)鍵酶CEL I價格昂貴，不利于TILLING大規(guī)模應(yīng)用。因此本實驗從芹菜中對CEL I進行了粗提取，并通過瓊脂糖電泳和毛細(xì)管電泳對其活性進行了鑒定。

與崔海瑞等[11]、Till 等[5]、韓鎖義等[7]報道的結(jié)果類似，本研究的實驗近一步證明芹菜的粗提物具有識別和切割異質(zhì)雙鏈體中的錯配堿基的活性。本實驗對TILLING酶切體系進行了近一步的優(yōu)化，酶切體系中酶的用量隨著檢測酶切產(chǎn)物的手段不同而不同。當(dāng)用瓊脂糖電泳檢測時，CEL I需要較高濃度，只需將初始CEL I抽提液稀釋1倍，酶切45～60 min就能得到明晰的酶切特征帶。而當(dāng)采用識別熒光信號的ABI 3500遺傳分析儀時，CEL I濃度稀釋到原液的20倍仍然能夠得到較好的結(jié)果（圖3A）。并且隨著CEL I酶濃度的升高，導(dǎo)致目的片段峰和酶切特征峰的豐度都迅速下降。推測其中的原因是，較高濃度CEL I能夠剪切標(biāo)記在DNA片段上熒光發(fā)光基團，其中具體機制還有待于進一步研究。但是此種現(xiàn)象的出現(xiàn)影響了ABI 3500遺傳分析儀在TILLING分析過程中的使用，因此，CEL I酶切后PCR產(chǎn)物的檢測方法應(yīng)該將瓊脂糖電泳粗篩，然后用ABI 3500遺傳分析儀確定酶切位點，最終對發(fā)生突變的片段進行測序，證實發(fā)生突變的位點和類型。

4 結(jié)論

本實驗從芹菜中提取了CEL I粗提物，實驗證明其具有識別和切割異質(zhì)雙鏈體中的錯配堿基的活性,基于此建立了適宜煙草TILLING實驗的CEL I粗提物酶切體系，并用毛細(xì)管電泳檢測酶切后熒光片段。該實驗體系的建立可為TILLING技術(shù)大規(guī)模和低成本地應(yīng)用于煙草功能基因組研究提供重要基礎(chǔ)。

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Establishment of TILLING experimental technique based on capillary electrophoresis

FU Qiang, ZOU Jie, ZHANG Jishun,WANG Yi, REN Xueliang
Guizhou Academy of Tobacco Science, Molecular Genetics Key Laboratory of China Tobacco,Guiyang 550081, China

CEL I enzyme that specifically cleaves mismatch in DNA double strands is one of the most important components of TILLING experiment platform. Crude extract of CEL I enzyme was obtained from celery growing in Guiyang of Guizhou province. A pair plasmids with a known single base difference were used as substrate to verify CEL I restriction enzyme activity of crude extracts, and cleavage products were detected by agarose gel electrophoresis and capillary electrophoresis, which confirmed CEL I activity in crude extracts. An effective CEL I digestion system was thus established: CEL I enzyme effectively cut mismatch DNA in 15 μL digestion reaction solution including 8 μL PCR product, 4.5 μL ddH2O, 1.5 μL 10×cleavage buffer (pH 7.5, 500 mmol/ L KCL, 100 mmol / L Tris-Cl, 15 mmol / L MgCl2) and 1μL the 20 times dilution of CEL I crude extraction after 60-min incubation under 42℃ .

TILLING; celery CEL I nuclease; ABI genetic analyzer; capillary electrophoresis

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.015

Q81 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）04-0075-04

貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目（黔科合NY字[2011]3047號）；中國煙草總公司重點項目（中煙辦[2010]221號）；中國煙草總公司重大專項（中煙辦[2012]146號）和貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象專項資金（黔科合人字[2013]02號）

付強（1984—），博士，主要從事煙草遺傳育種與蛋白質(zhì)組學(xué)研究，Email：nesta1984fu@sina.com.

任學(xué)良（1976—），Email：renxuel@126.com.

2013-05-14