吳藝飛 ,張戰(zhàn)泓,周曉波,巢進,田茂成,田峰,朱三榮,歐陽嫻,白占兵

1 湖南省蔬菜研究所 長沙 410125;2 湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心 長沙 410125;3 湖南省煙草公司湘西自治州公司 吉首 416000

農(nóng)藝與調(diào)制

云煙87烤煙品種突變株的離體快繁技術(shù)

吳藝飛1,2,張戰(zhàn)泓1,2,周曉波1,2,巢進3,田茂成3,田峰3,朱三榮3,歐陽嫻1,2,白占兵1,2

1 湖南省蔬菜研究所 長沙 410125;2 湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心 長沙 410125;3 湖南省煙草公司湘西自治州公司 吉首 416000

為探討特定條件下離體快繁對一些重要材料的優(yōu)良性狀進行迅速固定和繁殖的技術(shù)。以云煙87烤煙品種突變巨型株的休眠芽為試材，對其進行了打破休眠促使萌芽、愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽增殖和生根培養(yǎng)的研究。結(jié)果表明：打破休眠促使其萌芽的最佳培養(yǎng)基配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA；誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織效果最佳的培養(yǎng)基配方為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA；叢生芽增殖效果最佳的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA；MS+0.6 mg/L NAA對根系的生長最為有利。

烤煙；突變株；離體快繁

煙草(Nicotiana tabacumL．)屬茄科(Solanaceae)煙草屬(Nicotiana)一年生草本植物。自1973年基因工程誕生以來，煙草以其易于進行組織培養(yǎng)，容易得到再生的轉(zhuǎn)化植株而成為典型的基因工程模式植物，被譽為植物界的“果蠅”[1]。早在1950年初Skoog和崔澄等對煙草根、莖、葉進行了離體培養(yǎng)[2-3]。潘戰(zhàn)生等1989年研究了光和激素兩個因素對煙草葉片組織培養(yǎng)的調(diào)節(jié)作用[4]。隨后，很多學(xué)者進行了相關(guān)研究并取得了良好進展[5-10]。但他們所取的外植體材料均為幼嫩葉片，而本試驗材料為田間突變巨型株，取材時已值深冬，植株已經(jīng)老化無幼嫩葉片可以采用，因此取其已經(jīng)進入休眠的芽進行組織培養(yǎng)。本試驗旨在通過對煙草休眠芽進行組織培養(yǎng)，探討特定條件下，通過離體快繁對一些重要材料的優(yōu)良性狀進行迅速固定和繁殖的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2013年7月在湖南省蔬菜研究所重點實驗室完成。供試材料為烤煙品種云煙87，由湖南省煙草公司湘西自治州公司提供，于2013年1月采自湘西自治州保靖縣煙草公司試驗田中的突變巨型株，其生長勢極旺盛，株型比其它正常植株大2倍以上，株高2～4 m，煙葉130余片，而正常云煙87株高1.7～1.8 m，煙葉30余片。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的采集和滅菌

于2013年1月從湘西帶土采集煙草突變株植株，噴上少量水后帶回實驗室，用解剖刀將莖上的休眠芽快速切下，為減少芽傷口褐化造成成活率低，切下后馬上放入純水中備用。將切下的煙草芽先用75%酒精表面消毒30 s，再用0.1%升汞滅菌處理12 min，倒去廢液后，用無菌水沖洗4次，洗凈升汞殘液備用。

1.2.2 外植體接種和預(yù)培養(yǎng)

將滅菌處理后的外植體置于無菌紙上，用解剖刀快速切去已經(jīng)發(fā)褐的傷口表面，馬上將外植體接入萌芽培養(yǎng)基中，促進休眠芽的萌發(fā)。萌芽培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L）和1.0 mg/L NAA，每處理接種10瓶，每瓶2個芽，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計芽萌發(fā)情況，篩選出最佳萌芽培養(yǎng)基配方。

1.2.3 愈傷組織的誘導(dǎo)

休眠芽在萌芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d左右，待新芽萌發(fā)長出新葉后，將細嫩的新葉切成5 mm×5 mm大小，接種在新的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷組織的發(fā)生。愈傷組織培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加不同濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L）和NAA（0.3、0.6 mg/L），每處理接種5瓶，每瓶4個葉片，培養(yǎng)30 d后，記錄愈傷組織發(fā)生情況，篩選出最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。

1.2.4 叢生芽的誘導(dǎo)

在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d左右，待愈傷組織長至2～3 cm2大小時轉(zhuǎn)出，將愈傷組織切成1 cm2大小，轉(zhuǎn)至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生新芽。叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加不同濃度的6-BA（1.0、2.0、3.0 mg/L）和0.3 mg/LNAA，每處理接種5瓶，每瓶6個愈傷組織，培養(yǎng)30 d后，記錄叢生芽發(fā)生情況，篩選出最佳叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方。

1.2.5 生根培養(yǎng)

在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d左右，待新芽長至2 cm左右高，有3～4片新葉時，將幼芽切下，切除基部的愈傷組織，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)新根的發(fā)生。生根培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基添加不同濃度的NAA（0、0.3、0.6 mg/L），每處理接種5瓶，每瓶4株，培養(yǎng)25 d后，統(tǒng)計根系生長情況，篩選出最佳煙草生根培養(yǎng)基配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度對促進休眠芽萌發(fā)的影響

通過表1，可以看出，添加不同激素濃度的各處理萌芽率均不是很高，各處理間差異較顯著，其中萌芽效果最好的是處理2，接種20個芽，有10個萌發(fā)長出了葉片，萌芽率達50%，處理3次之，為25%，效果最差的是處理1 ，接種的20個芽中，僅3個萌芽，萌芽率為15%。因此，最佳的誘導(dǎo)休眠芽萌發(fā)的培養(yǎng)基組合為MS添加2.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L NAA。

2.2 不同激素濃度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將新長出的幼嫩新葉切成5 mm×5 mm大小，接至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)10 d左右可見葉周開始膨大，愈傷組織陸續(xù)產(chǎn)生，培養(yǎng)30 d左右增長至最大，統(tǒng)計愈傷組織發(fā)生情況，見表2和圖1。通過表2可知，添加不同濃度的激素種類的配比對愈傷組織的產(chǎn)生影響較大。隨著6-BA和NAA濃度的升高，愈傷組織產(chǎn)生的量呈上升趨勢，但濃度過高會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，表現(xiàn)為產(chǎn)生的愈傷組織為白色透明狀，這種愈傷組織分化芽的能力較低，產(chǎn)生的芽質(zhì)量差。以處理3，即MS添加3.0 mg/L 6-BA和0.3mg/L NAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織的效果最好，產(chǎn)生的愈傷組織多，質(zhì)地疏松，色澤呈淺綠色，分化芽的能力強。

2.3 不同激素濃度對叢生芽誘導(dǎo)的影響

將顏色淺綠，質(zhì)地較疏松的愈傷組織切成1 cm2大小，轉(zhuǎn)至叢生芽增殖培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽。培養(yǎng)7 d左右可見愈傷組織上陸續(xù)分化出很多芽點，隨著時間的推移，培養(yǎng)15～20 d，部分芽點開始膨大，分化出莖、葉，長成植株，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計愈傷組織分化叢生芽長成植株情況見表3和圖2。由表3可知，6-BA濃度在一定范圍內(nèi)與愈傷組織產(chǎn)生芽點的數(shù)量呈正相關(guān)；但同時，隨著6-BA濃度的升高，玻璃化現(xiàn)象也愈嚴重，分化成苗的效率反而下降。以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA為最佳的愈傷組織誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基，產(chǎn)生的芽點較多，分化成苗的效率最高，產(chǎn)生的植株最為健壯。

表3 不同激素濃度對叢生芽誘導(dǎo)的影響Tab. 3 Effect of different hormone concentrations on shoot proliferation

2.4 不同激素濃度對煙草生根的影響

當分化的植株長至2～3 cm，有3～4片葉時，將其從基部切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)7～10 d可見基部出現(xiàn)根尖突起，逐漸伸長，10～15 d可長至1～2 cm，培養(yǎng)25 d左右可成苗，統(tǒng)計生根情況見表4和圖3。通過表4可知，NAA的濃度對植株生根的影響比較大，部分植株不添加NAA也能生根，但生根的效率不高，產(chǎn)生的根系細，根毛少，移栽成活率低；以添加0.6 mg/L NAA的培養(yǎng)基生根效果最好，產(chǎn)生的根系多而粗，根毛多，移栽容易成活。

表4 不同激素濃度對生根的影響Tab. 4 Effect of different hormone concentrations on rooting

3 討論與結(jié)論

試驗結(jié)果表明，打破休眠促使其萌芽的最佳培養(yǎng)基配方為MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA；誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織效果最佳的培養(yǎng)基配方為MS+3.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA；叢生芽增殖效果最佳的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA；MS+0.6 mg/L NAA對根系的生長最為有利。

由于所取的材料為田間突變巨型株，只有通過無性繁殖才能將其優(yōu)良的性狀保留下來，但發(fā)現(xiàn)它時已是冬季，植株已值老年期且已進入休眠，無幼嫩的葉片和莖段可供培養(yǎng)，因此取其休眠芽進行組織培養(yǎng)成為必然。在添加了一定的6-BA和NAA后，休眠芽的萌芽勢仍然不高，效果最好的也只有50%，大部分幼芽出現(xiàn)了不同程度的褐化或者不萌動的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在一定程度上抑制了幼芽的萌發(fā)[11]。因此下一階段可以采取添加防褐化劑等方法來減少褐化，提高培養(yǎng)效率，具體防褐化劑種類和濃度有待進一步研究。

植株培養(yǎng)過程中出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象很嚴重，部分甚至達到50%。玻璃化現(xiàn)象在很多其它植物組織培養(yǎng)中也普遍存在，是制約組培效率的因素之一。我們在組培過程中發(fā)現(xiàn)一些措施可以緩解這種現(xiàn)象：接種前將培養(yǎng)瓶倒置一會，把里面多余的水分倒掉再接種，以減少培養(yǎng)過程中的濕度過大造成玻璃化；培養(yǎng)室的溫度不宜過高，在25℃～28℃為宜；繼代周期不能太長，一般20～30 d為宜，最多不能超過2個月。

圖1 愈傷組織發(fā)生情況Fig. 1 Callus condition

圖2 叢生芽發(fā)生情況Fig. 2 Shoot proliferation condition

圖3 培養(yǎng)30天后生根效果Fig. 3 Rooting condition 30 days after cultivation

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Invitrorapid propagation of mutant strain of flue-cured tobacco cv. Yunyan 87

WU Yifei1,2, ZHANG Zhanhong1,2, ZHOU Xiaobo1,2, CHAO Jin3,TIAN Maocheng3,TIAN Feng3, ZHU Sanrong3, OUYANG Xian1,2, BAI Zhanbing1,2
1 Hunan Vegetable Research Institute, Changsha 410125, China；2 Hunan Vegetable Research and Development Center, Changsha 410125, China；3 Xiangxi Autonomous Prefecture Tobacco Company, Jishou 416000, Hunan, China

Mutant giant strains of Yunyan 87 dormant buds were tested for breaking of dormancy to germination, callus induction, shoot proliferation and rooting cultivation. Results showed that: the optimum medium for breaking dormancy to germination was MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA; the optimum medium for callus induction was MS+3.0mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA; the medium with optimum shoot proliferation effect was MS+1.0mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA; MS+0.6mg/L NAA was the best condition for root growth.

flue-cured tobacco; mutant strain;in vitrorapid propagation

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.008

S572.03 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）04-0037-04

湖南省煙草公司湘西自治州公司技術(shù)研究項目 “利用嫁接技術(shù)和光合細菌菌劑防治煙草根莖病害的技術(shù)研究”（2013-15Aa01）

吳藝飛（1982—），碩士，從事植物組織培養(yǎng)和菜薹遺傳育種工作， Email:406522996@qq.com

田 峰(1963—),大學(xué),從事煙草技術(shù)研究與推廣，Email:hvizhanhong@163.com

2013-08-05