丁睿，王乃順，于存峰，馬雁軍，王麗麗，夏冰冰，王允白

1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081；3.山東中煙有限責任公司，濟南 250100 4. 上海煙草( 集團) 公司技術(shù)中心北京工作站，北京 101121；5.山東臨沂煙草有限公司，臨沂 276000

不同產(chǎn)區(qū)曬紅煙TSNAs含量分析

丁睿1、2，王乃順3，于存峰3，馬雁軍4，王麗麗5，夏冰冰1、2，王允白1

1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081；3.山東中煙有限責任公司，濟南 250100 4. 上海煙草( 集團) 公司技術(shù)中心北京工作站，北京 101121；5.山東臨沂煙草有限公司，臨沂 276000

采用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS-MS）對我國7個地方曬紅煙主產(chǎn)區(qū)共77個樣品的煙葉TSNA進行了檢測和分析，結(jié)果表明：我國不同產(chǎn)區(qū)曬紅煙煙葉TSNA含量存在顯著差異，煙葉總TSNA含量分布在0.463～66.236 μg/g之間，不同產(chǎn)區(qū)從高到低順序為：浙江＞江西＞山東＞四川＞吉林＞湖南＞貴州。相關分析顯示煙葉中的TSNAs與生物堿存在顯著或極顯著相關關系。

曬紅煙；煙草特有亞硝胺；差異

煙草特有亞硝胺(tobacco-specific nitrosamine，TSNA)是煙草生物堿和亞硝酸鹽發(fā)生亞硝化反應生成的化合物，在煙葉和煙氣中都有存在。現(xiàn)已證實的有8種煙草特有的亞硝胺，其中最主要的有4種: N-亞硝基降煙堿(NNN)，4-(N-甲基-亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮 (NNK)，N-亞硝基假木賊堿(NAB)和N-亞硝基新煙堿(NAT)[1]。動物試驗表明，NNK和NNN具有一定的致癌性和致突變性[2-4]，因此認為，TSNA的含量和組成直接影響煙草制品的安全性。

研究證明，不同類型煙草的TSNA含量有顯著性差異。史宏志等對來自不同產(chǎn)地的烤煙、白肋煙和香料煙煙葉進行分析后發(fā)現(xiàn)，白肋煙的煙葉中TSNA含量最高，平均為10.25 μg/g；香料煙次之，平均為0.432 μg/g；烤煙一般為0.156～0.42 μg/g，遠低于白肋煙和部分香料煙[5]。白肋煙等較高TSNA含量的晾曬煙的使用,致使混合型卷煙的TSNA含量提高，影響了混合型卷煙的安全性。史宏志等對我國的9種烤煙型卷煙和5種混合型卷煙的TSNA含量進行分析后發(fā)現(xiàn)，烤煙型卷煙的TSNA含量平均為0.197 μg/g；混合型卷煙的TSNA含量平均為3.302 μg/g[5]。

曬紅煙具有獨特的吸味和香氣特征，可以作為混合型卷煙的原料應用到卷煙之中，在卷煙葉組配方中可用來增香和改進吸味[6]。研究表明，中式低焦油卷煙配方中加入一定比例的曬紅煙能顯著提高煙氣的香氣量、煙氣濃度和吸食滿足感[7]。我國的曬紅煙資源非常豐富且分布廣泛，是發(fā)展混合型卷煙的寶貴資源。但目前針對我國曬紅煙的研究比較少，對于不同產(chǎn)地曬紅煙的TSNA含量的研究更是鮮有報道。本文研究了不同產(chǎn)區(qū)、不同品種煙葉TSNA的含量，對于客觀評價其煙葉的產(chǎn)品質(zhì)量、安全性及卷煙配方可用性，對于我國卷煙工業(yè)合理使用曬紅煙開發(fā)中式混合型卷煙，提高卷煙安全性具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

2012年在貴州、湖南、吉林、四川、山東、江西和浙江7個曬紅煙產(chǎn)區(qū)共采集具有代表性的地方曬紅煙中部葉樣品77個。煙葉抽去主脈，60℃烘干后磨碎，過40目篩，用于煙葉成分檢測。

1.1.2 試劑

標準品：NNK、NNN、NAB、NAT，內(nèi)標：NNN-d4、NNK-d4、NAB-d4和 NAT-d4，純度＞98%；超純水，電導率≥18.2MΩ·cm；甲醇，色譜純；乙腈，色譜純；甲酸銨，純度≥99 %；甲酸、乙酸銨，色譜純。

1.1.3 儀器

使用儀器為美國Agilent公司生產(chǎn)的Agilent 1200高效液相色譜議，美國應用生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的API 5500型三重四極桿質(zhì)譜議，美國Millipore公司生產(chǎn)的Milli-Q 50 超純水儀，德國Sartorius公司生產(chǎn)的CP2245 分析天平，上海安譜科學儀器有限公司生產(chǎn)的13 mm × 0.22 μm水相針式過濾器，英國Filtrona公司450型20通道吸煙機，常州國華電器有限公司生產(chǎn)的HY-8調(diào)速振蕩器。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

準確稱取1.00 g樣品置于50 mL錐形瓶中，然后加入0.1 mL 2000 ng/mL的內(nèi)標溶液和30 mL 100 mmol/L的乙酸銨溶液，用振蕩器以130 rpm振蕩30 min，然后用0. 22 μm水相針式過濾器過濾到2 mL的色譜瓶中進行LC-MS/MS分析。參照張杰等[8]方法。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 SB-C18(4.6×150 mm, 2.7 μm，美國 Agilent 公司)；柱溫：50 ℃；進樣量:5 μL；流動相：A：水(含0.1 %乙酸，體積分數(shù))，B：甲醇(含0.1 %乙酸，體積分數(shù))；洗脫方式：等度洗脫，流速 0.30 mL/min；預平衡時間：5 min。參照張杰等[8]方法。

1.2.3 質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；離子噴霧電壓(Ionspray Voltage，IS)：5000 V；霧化氣流速(GS1，N2)：3.8 kg/cm2；輔助加熱氣流速(GS2，N2)：3.8 kg/cm2；氣簾氣流速 (Curtain Gas，CUR，N2)：1.0 kg/cm2；碰撞氣流速(Collision Gas，CAD，N2)：0.4 kg/cm2；離子源溫度(TEM)：550 ℃；駐留時間(Dwell Time)：50 ms；入口電壓 (Entrance Potential，EP)：10 V；出口電壓(Collision Cell Exit Potential，CXP)：9 V。參照張杰等[8]方法。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計分析主要運用Excel2010對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，運用SAS9.1軟件進行方差分析、簡單相關、偏相關分析和逐步回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)曬紅煙煙葉TSNA變異及含量差異分析

對所取樣品煙葉的TSNA含量進行測定和對各產(chǎn)區(qū)樣品煙葉TSNA含量進行方差分析，統(tǒng)計結(jié)果見表1。由表1可知，不同產(chǎn)區(qū)曬紅煙煙葉TSNA含量存在顯著差異。總TSNA含量分布在0.463～66.236 μg/g之間，其中貴州產(chǎn)區(qū)樣品的TSNAs含量最低，均值為1.715 μg/g，浙江產(chǎn)區(qū)樣品的TSNAs含量最高，均值達到42.848 μg/g，是貴州產(chǎn)區(qū)的25倍。四川、吉林、湖南和貴州產(chǎn)區(qū)間差異不顯著，而與其他產(chǎn)區(qū)差異極顯著；浙江、江西、山東產(chǎn)區(qū)均與其他產(chǎn)區(qū)有極顯著差異。從提高卷煙安全性角度考慮，貴州、湖南和吉林產(chǎn)區(qū)的曬紅煙樣品因煙葉中的TSNA含量較低，較適宜作混合型卷煙的原料。

從單一TSNA成分來看，它們在各產(chǎn)區(qū)含量的差別與TSNAs含量差別基本一致。NNN含量以浙江

產(chǎn)區(qū)最高，貴州產(chǎn)區(qū)最低。四川、吉林、湖南和貴州產(chǎn)區(qū)間差異不顯著，而與其他產(chǎn)區(qū)差異極顯著；浙江、江西、山東產(chǎn)區(qū)均與其他產(chǎn)區(qū)有極顯著差異。NAT含量同樣以浙江產(chǎn)區(qū)最高，貴州產(chǎn)區(qū)最低。四川、吉林、湖南和貴州產(chǎn)區(qū)間差異不顯著；江西和山東產(chǎn)區(qū)間差異不顯著；浙江產(chǎn)區(qū)與其它產(chǎn)區(qū)差異極顯著。NNK含量以江西產(chǎn)區(qū)最高，貴州產(chǎn)區(qū)最低；NAB含量以江西產(chǎn)區(qū)最高，吉林產(chǎn)區(qū)最低。NNK與NAB的差異分析相同：四川、吉林、湖南、貴州和山東產(chǎn)區(qū)間差異不顯著；江西和浙江產(chǎn)區(qū)均與其他產(chǎn)區(qū)有極顯著差異。

從TSNA組成來看，除江西和湖南兩產(chǎn)區(qū)，NNN所占TSNAs的比例最高外，其他5個產(chǎn)區(qū)中，均是NAT所占總TSNA的比例最高。在所有產(chǎn)區(qū)中，NAT與NNN含量之和占TSNAs的比例為85.868%～95.487%，是TSNA中的主要成分。

表1 不同產(chǎn)區(qū)曬紅煙煙葉中TSNA含量及差異分析Tab. 1 Analysis of TSNA content and differences in red sun-cured tobacco from different regions

2.2 不同產(chǎn)區(qū)曬紅煙煙葉生物堿含量分析

為探索曬紅煙TSNA與煙葉生物堿的相關性，對所取的77個曬紅煙樣品煙葉的生物堿含量進行了測定，統(tǒng)計結(jié)果見表2。由表2可知，曬紅煙生物堿含量的標準偏差均較小，說明樣品的生物堿含量比較穩(wěn)定?？偵飰A含量分布在18.698～73.746 mg/g之間。其中浙江產(chǎn)區(qū)樣品的總生物堿含量最高，均值達到67.108 mg/g，四川產(chǎn)區(qū)樣品的總生物堿含量最低，均值為34.609 mg/g。不同產(chǎn)區(qū)曬紅煙煙葉總生物堿含量均值從高到低順序為：浙江＞山東＞湖南＞吉林＞江西＞貴州＞四川。

表2 不同產(chǎn)區(qū)曬紅煙煙葉生物堿含量分析Tab. 2 Analysis of alkaloid content in red sun-cured tobacco from different regions

2.3 煙葉TSNA與煙葉生物堿的相關分析

為了明確煙葉TSNA與煙葉生物堿間的關系，從而探究TSNA的來源和降低TSNA的方法，本研究通過簡單相關分析、偏相關分析和逐步回歸分析對曬紅煙樣品的煙葉TSNA與煙葉生物堿進行分析，結(jié)果見表3所示。

由簡單相關系數(shù)可知TSNAs與煙堿、假木賊堿、總生物堿呈極顯著正相關，與降煙堿呈顯著正相關。由偏相關系數(shù)可知：TSNAs與新煙草堿呈極顯著負相關，與假木賊堿呈極顯著正相關。以上結(jié)果與簡單相關分析結(jié)果不完全一致，分析結(jié)果的差異說明新煙草堿、假木賊堿對TSNA的直接作用較大，而煙堿、降煙堿對TSNA的間接作用較大。

表3 煙葉TSNA與生物堿的相關系數(shù)Tab. 3 Correlation coefficients of tobacco TSNA and alkaloids

為進一步探明煙葉TSNA與煙葉生物堿的相關性，以煙葉中TSNA組分：NAT(Y1)、NNN(Y2)、NNK(Y3)、NAB(Y4)、TSNAs(Y5)為因變量，以煙堿(X1)、降煙堿(X2)、新煙草堿(X3)、假木賊堿(X4)、總生物堿(X5)為自變量，做逐步回歸，并對回歸模型進行顯著性檢驗，均達到極顯著水平，建立的逐步回歸方程如下：

Y1= 3.814 -3.833X3+53.115X4（R2=0.5768）

Y2= -17.640 -2.792X3+36.592X4（R2=0.6318）

Y3= -1.612 -0.405X2（R2=0.5270）

Y4= -0.932 -0.278X3+2.189X4（R2=0.6761）

Y5= -2.841+0.267X1-7.927X3+55.674X4（R2=0.6353）

Y2、Y4、Y5模型的決定系數(shù)R2均大于0.63，說明應用當前模型能解釋63%以上的因變量變化，由此可見，該擬合方程具有較大的參考價值。Y1、Y3模型的決定系數(shù)R2均大于0.52，說明擬合方程有一定的參考價值。由此可知：

煙葉NAT與新煙草堿、假木賊堿有（極）顯著相關；NNN與新煙草堿、假木賊堿有（極）顯著相關；NNK與降煙堿有（極）顯著相關；NAB與新煙草堿、假木賊堿有（極）顯著相關；TSNAs與煙堿、新煙草堿、假木賊堿有（極）顯著相關。

3 討論與結(jié)論

不同產(chǎn)區(qū)曬紅煙煙葉TSNA含量從低到高順序為貴州＜湖南、吉林和四川＜山東和江西＜浙江。不同產(chǎn)區(qū)曬紅煙煙葉TSNA含量存在顯著差異，這可能是品種的遺傳特性和獨特的生態(tài)條件與不同的栽培調(diào)制方式等作用的結(jié)果[9-11]。進一步開展生態(tài)條件、品種、栽培條件與調(diào)制方式等對TSNA含量的影響的研究，篩選不同產(chǎn)區(qū)的主栽低TSNA煙葉品種、規(guī)范栽培條件和調(diào)制技術(shù)，降低曬紅煙煙葉的TSNA，提高卷煙原料的安全性應是下一步研究的重點。

相關和回歸分析顯示煙葉NAT、NNN、NAB、TSNAs均與新煙草堿呈直接負相關，與假木賊堿呈直接正相關；煙葉NNK與降煙堿呈間接接負相關；TSNAs與煙堿呈間接正相關。這與TSNAs與其前體物質(zhì)間的相互轉(zhuǎn)化有關[15]。

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Determination of TSNAs in red sun-cured tobacco leaves from different growing areas

DING Rui1，2，WANG Naishun3，YU Cunfeng3，MA Yanjun4，WANG Lili5，XIA Bingbing1，2，WANG Yunbai1
1. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China;2. Graduate School, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3. China Tobacco Shandong Industrial CO., Ltd, Jinan 250100, China;4. Beijing Technology Centre, Shanghai Tobacco Co. Ltd.，Beijing 101121，China;5. Shandong Linyi Tobacco Co., Ltd, Linyi, 276000, China

Contents of TSNAs in 77 red sun-cured tobacco samples from 7 growing areas were determined by HPLC-MS-MS. Results showed that there were significant differences among sample leaves. Total TSNAs contents ranged from 0.463 to 66.236 μg/g. Leaves from Zhejiang has the highest TSNAs level, followed by those from Jiangxi, Shandong, Jilin, Hunan, Guizhou and Sichuan. Correlations found between TSNAs and tobacco alkaloids were significant or highly significant.

red sun-cured tobacco; tobacco-specific nitrosamine; difference

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.004

TS411 文獻標志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）04-0018-05

上海煙草集團北京卷煙廠資助項目(No. JZ12004)

丁睿（1987—），碩士研究生，研究方向為煙草化學，Email：dingrui998877@163.com

王允白（1964—），碩士，研究員，研究方向為煙草化學與品質(zhì)，Email：ycswyb@163.com

2014-02-17