朱 杰，高艷飛

（1.大連醫(yī)科大學第二臨床學院 檢驗科，遼寧 大連116027；2.遼河油田第二醫(yī)院 檢驗科，遼寧 盤錦12400）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以克隆性惡性漿細胞（骨髓瘤細胞）在骨髓中異常增殖，并伴有單克隆免疫球蛋白（monoclonal immunoglobulin）增多為特征的疾病，多發(fā)于中老年人，臨床表現(xiàn)多種多樣，主要表現(xiàn)為骨髓瘤細胞增生、浸潤和破壞骨組織及髓外其他組織，出現(xiàn)骨痛、病理性骨折、貧血、出血，以及骨髓瘤細胞產(chǎn)生大量單克隆免疫球蛋白而出現(xiàn)感染、高鈣血癥、腎臟病變、高粘滯血癥、淀粉樣變等。經(jīng)典的化療方案緩解率低，隨著新藥問世、聯(lián)合化療和骨髓造血干細胞移植等新技術的應用，MM患者的緩解率不斷提高。近年來研究表明，多參數(shù)流式細胞術免疫表型分析有助于MM診斷，緩解后患者體內(nèi)MRD分析是判斷療效和預后的重要指標，目前國內(nèi)有關MRD的報道多是應用于骨髓瘤細胞的膜表面免疫表型。本研究應用多參數(shù)流式細胞術進行胞漿輕鏈的測定來建立MRD分析方案，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

樣本來源：選取2010年1月至2012年11月大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院住院確診MM患者中經(jīng)化療后完全緩解病例45例，其中女性12例，男性33例，中位年齡60歲；初診骨髓細胞學檢查瘤細胞占（15－95%），其中分泌型為37例（IgG型為27例，IgA型為10例）輕鏈型為5例（λ鏈型4例，κ鏈型1例），不分泌型3例，其完全緩解后形態(tài)學及血清學均為陰性。

1.2 儀器

流式細胞儀：FACSCalibur美國BD公司。

1.3 試劑

CD38－FITC／CD56－PE／CD19－Percp、 CD138－PE、CD45－APC、κ－FITC／λ－PE／ CD19－Percp、κ－FITC／λ－PE、IgG2a－FITC、IgG1－PE，溶 血 素、破 膜劑，以上試劑均購自美國BD公司。

1.4 標本的采集

無菌操作抽取0.2ml骨髓液涂片作顯微鏡形態(tài)學檢查。另抽取2ml置于EDTA－K2抗凝血常規(guī)管作微小殘留病變檢測，48h內(nèi)完成檢驗。

1.5 標本的處理

骨髓涂片行瑞氏－吉姆薩染色，顯微鏡下觀察并分類計數(shù)200個有核細胞?？鼓墓撬枰簂 ml，加3 ml PBS液，混勻后，在水平離心機上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，計數(shù)白細胞數(shù)，調節(jié)至5×106／ml，制成細胞懸液備用。

1.6 實驗方法

1.6.1 胞膜的標記及胞漿內(nèi)輕鏈的標記

①胞膜的標記：每管100μl細胞懸液分別加入（IgG2a－FITC、IgG1－PE、CD45－APC）、（CD38－FITC／CD56－PE／CD19－Percp、CD45－APC）、 （CD138－PE、CD45－APC）、（κ－FITC／λ－PE／CD19－Percp、CD45－APC）各20μl，混勻避光15min，加配置好的溶血素2ml，避光10min，在水平離心機上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，混勻備用。

②胞漿內(nèi)輕鏈的標記：取兩只試管，每管100μl細胞懸液分別加入CD45－APC 20μl，避光15min，再加入破膜劑A液100μl，避光10min，加溶血素2 ml，避光10min，在水平離心機上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加入破膜劑B液50μl，分別加 入 （IgG2a－FITC、IgG1－PE）、（κ－FITC／λ－PE），避光15min，加2ml PBS洗滌，在水平離心機上離心（1 500r／min，5min），棄去上清液，加1ml PBS液，混勻備用。

1.6.2 流式細胞儀測定 用熒光微球校準儀器及補償后，用Cellquset軟件收取200000－400000個細胞，通過CD45／SSC和CD38／CD56聯(lián)合設門，確定瘤細胞的位置及抗原表達情況。

1.6.3 MRD分析 以胞漿κ／λ抗體為核心，組合CD38、CD56、CDl9、CD45、CD138進行四色 MRD分析。根據(jù)此前的免疫分型，本研究設計了以下2種瘤細胞的免疫組合：CD19－CD38＋CD56＋CD45－CD138＋和CD19－CD38＋CD56－CD45－CD138＋，來尋找漿細胞的位置，最后根據(jù)異常胞漿κ／λ的表達，來確定MRD的陽性率，其目的主要是排除正常漿細胞和其他有核細胞干擾。結果判斷：目標細胞異常輕鏈表達＞0.1%[1－4]，即為 MRD陽性。

1.6.4 數(shù)據(jù)分析 應用SPSS11.1軟件包進行統(tǒng)計學分析，對應兩組應用t檢驗。

2 結果

2.1 45例形態(tài)學及血清學完全緩解的多發(fā)性骨髓瘤患者確診前免疫表型及胞漿輕鏈表達見表1，其中免疫表型為CD38＋CD56－CD138＋CD19－CD45－主要見于輕鏈型和不分泌型。

2.2 兩種免疫表型的 MRD陽性率見表2，其中CD38＋CD56－CD138＋CD19－CD45－的MRD的陽性率明顯高于CD38＋CD56＋CD138＋CD19－CD45－，兩者比較P＜0.05。

2.3 兩種胞漿輕鏈的MRD陽性率見表3，兩者比較無顯著性差異，P＞0.05。

2.4 45例MM患者緩解后進行MRD檢測，其中14例MRD陽性，31例MRD陰性。對此45例患者進行隨訪，病例隨訪時間最長為24個月，最短為2個月。MRD陰性組4例復發(fā)（13%），MRD陽性組10例復發(fā)（71%），兩組復發(fā)率差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。MRD陰性組的累積無病生存時間中位數(shù)為15.53（9.35－21.62）個月，明顯長于 MRD陽性組的9.75（3.69－14.24）個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05。結果見表4。

表1 45例多發(fā)性骨髓瘤細胞確診時免疫表型及胞漿輕鏈的表達

表2 不同免疫表型骨髓瘤的MDR的陽性率

表3 不同胞漿輕鏈型骨髓瘤的MDR的陽性率

表4 不同MDR表現(xiàn)的復發(fā)率和生存期

3 討論

MM傳統(tǒng)意義上CR患者體內(nèi)仍殘留約1010個腫瘤細胞，被認為是疾病進展和復發(fā)的根源。傳統(tǒng)的形態(tài)學檢測和血、尿蛋白電泳等方法分析MRD有一定的局限性。形態(tài)學是最普遍、最基礎的檢測手段，在一定程度上可反映治療的效果。但骨髓瘤細胞常呈灶狀或斑點狀分布，穿刺部位不同、骨髓稀釋、制片不佳導致骨髓瘤細胞堆積在片尾或邊緣都會降低瘤細胞的比例，且形態(tài)學上不易與正常漿細胞區(qū)分，也難以反映緩解期內(nèi)腫瘤負荷的變化，且靈敏度僅能達到5×10－2水平。血、尿蛋白電泳可間接反映腫瘤負荷量，但特異性較低，敏感度也不高。我們采用流式細胞術研究MM細胞的免疫表型特征及胞漿輕鏈的表達，以期建立更好的監(jiān)測MRD的方法，為MM的預后判斷和個體化治療提供可靠依據(jù)[5－8]。

根據(jù)文獻報道CD138（Syndecan－1）是漿細胞特異性抗原，新近歐洲骨髓瘤協(xié)作組（European MyelomaNetwork，EMN）在流式細胞術免疫分型方面達成共識，推薦 MM分型至少要用CD38、CD138、CD45中的一種抗體識別漿細胞，初診設漿細胞門要基于CD38／CD138的共表達（應有文獻支持）。我們在此基礎上增加CD56、CD19、胞漿輕鏈（κ／λ）的檢測，在45例的患者中，瘤細胞的免疫表型為兩種CD38＋CD56＋CD138＋CD19－CD45－和CD38＋CD56－CD138＋CD19－CD45－，并且都表達一種胞漿輕鏈，根據(jù)以上免疫表型，我們利用CD38、CD56、CD138、CD19、CD45來確定漿細胞的位置，并檢測胞漿內(nèi)輕鏈的含量來確定是否是骨髓瘤細胞的殘余。這比其他的文獻報道的僅僅利用漿細胞的膜表面的標志來確定瘤細胞的含量更加準確和客觀。利用瘤細胞產(chǎn)生單克隆的胞漿輕鏈的特性，避免把一些正常的漿細胞記入為瘤細胞[9－11]。

在本研究中發(fā)現(xiàn)免疫表型為CD38＋CD56－CD138＋CD19－CD45－

的多發(fā)性骨髓瘤患者均為輕鏈型和不分泌型，并且MRD的檢測均為陽性，提示此型的預后較差，但因收集的標本例數(shù)較少，此結果在今后的工作中收集到更多的標本再詳述。

MRD陽性的患者其復發(fā)率高于陰性的患者，而生存期短于陰性的患者，這就為臨床監(jiān)測和治療骨髓瘤疾病提供了可靠的依據(jù)。對于處于完全緩解期的骨髓瘤患者，如果發(fā)現(xiàn)MRD陽性，應該鞏固治療，以期望 MRD轉為陰性，來獲得更好的療效[12，13]。

對于骨髓瘤MRD的檢測，我們認為初診時應全面分析MM患者免疫表型和胞漿輕鏈，特別是對一些輕鏈型和不分泌型的骨髓瘤患者，檢測胞漿輕鏈顯得尤為重要，這樣才能為以后的MRD檢測提供更可靠的依據(jù)。

盡管高劑量化療聯(lián)合自體造血干細胞移植已經(jīng)可以使多數(shù)MM患者達到完全緩解，但復發(fā)仍是臨床影響患者生存期的主要問題。多參數(shù)流式細胞術是目前敏感性和特異性都很高的檢測MRD的方法[14，15]。應用四色免疫熒光流式細胞術，CD45－APC／SSC及 CD38／CD56／CD19 及 CD138聯(lián)合設門，通過檢測胞漿內(nèi)輕鏈（cκ鏈、cλ鏈）對多發(fā)性骨髓瘤微小殘留病變監(jiān)測以及臨床判斷預后具有重要價值，并對臨床開展相關治療具有指導意義。

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