張義紅 許文靜 楊 坤

1(中國科學(xué)院深圳先進技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)納米科學(xué)技術(shù)學(xué)院 蘇州 215123)

1 引 言

近年來，隨著材料學(xué)、生物學(xué)、電化學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，電化學(xué)傳感技術(shù)取得了長足進步，大量的新型電化學(xué)傳感器先后被報道。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，傳統(tǒng)的檢測方法因檢測周期長、靈敏度低、操作繁瑣，在臨床應(yīng)用中受到限制。因此開發(fā)快速簡單、靈敏度高、特異性好的檢測方法具有重大科學(xué)意義與應(yīng)用價值。作為一種新型的檢測手段，電化學(xué)生物傳感器已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)與藥學(xué)篩選等領(lǐng)域[1-4]。

電化學(xué)傳感技術(shù)的核心是傳感器。傳感器是由活性識別物質(zhì)和信號轉(zhuǎn)換器組成的檢測裝置，它將感受到的信息按一定規(guī)律轉(zhuǎn)換為電信號的信息輸出，從而將信息轉(zhuǎn)換成可測量信號[5]。電化學(xué)傳感器具有制備簡單、成本低、操作簡單、快速、穩(wěn)定性好、特異性強、靈敏度高及不破壞測試體系等諸多優(yōu)點[1,5]，在臨床醫(yī)學(xué)[6,7]、藥物檢驗[8,9]、食品分析[10]和環(huán)境監(jiān)測[11,12]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，是目前發(fā)展最成熟的一種傳感器件。

本文簡單介紹了電化學(xué)生物傳感器的工作原理和分類，重點綜述了電化學(xué)生物傳感器近年來的研究進展及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，并對電化學(xué)生物傳感器目前存在的問題和發(fā)展前景進行展望。

2 電化學(xué)生物傳感器

2.1 基本原理

電化學(xué)生物傳感器主要分為生物分子識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件兩部分。生物分子識別元件由具有分子識別功能的生物敏感膜(如酶、微生物、組織、抗體抗原、核酸和細胞等)組成[13]，用于檢測樣品中是否含有待測物質(zhì)。識別元件檢測到的信號進一步由信號轉(zhuǎn)換元件轉(zhuǎn)換為可測量的電化學(xué)信號。根據(jù)可測量電化學(xué)信號的不同可分為電導(dǎo)型電化學(xué)生物傳感器、電位型電化學(xué)生物傳感器、電流型電化學(xué)生物傳感器與阻抗型電化學(xué)傳感器等[14,15]。其中，電導(dǎo)型電化學(xué)生物傳感器是測量溶液中一對電極間的電導(dǎo)變化；電位型電化學(xué)生物傳感器是測量工作電極與參比電極間的電位變化；電流型電化學(xué)生物傳感器是在恒電壓條件下測量通過電化學(xué)池的電流；而阻抗型電化學(xué)傳感器則是測量交流電勢與電信號的比值隨正弦頻率的變化。

2.2 電化學(xué)生物傳感器的分類

根據(jù)生物分子識別元件的生物敏感膜的不同，電化學(xué)生物傳感器大致可分為酶傳感器[16]、核酸適體傳感器[17]、免疫傳感器[18]與微生物傳感器[19]等。因酶傳感器、核酸適體傳感器和免疫傳感器在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域、食品檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具備廣闊的應(yīng)用前景，近年來的研究也多集中于此，因此這三種電化學(xué)生物傳感器得到了更為顯著的發(fā)展。

2.2.1 電化學(xué)酶傳感器

電化學(xué)酶傳感器將酶與底物相互作用和電化學(xué)分析功能相結(jié)合，是目前研究最廣泛的電化學(xué)生物傳感器[18]，其典型應(yīng)用為葡萄糖的檢測。葡萄糖氧化酶和辣根過氧化酶在酶傳感器的構(gòu)建中被廣泛應(yīng)用。電化學(xué)酶傳感器由 Clark 和 Lyons于 1962 年首次提出[20]，此后得到了迅速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于食品安全、環(huán)境監(jiān)測、重金屬和農(nóng)藥檢測等領(lǐng)域[21-24]。近年來，新型的納米技術(shù)和材料科學(xué)在電化學(xué)酶傳感器上的成功應(yīng)用，進一步推動了電化學(xué)酶傳感器的進步。

圖1 親水性基團與酶之間導(dǎo)電性及相互作用的概念模型Fig. 1. Conceptual model of the conductivity and interactions between the hydrophilic groups and the enzyme

圖1 所示為典型的電化學(xué)酶傳感器構(gòu)建方法。KOH 活化電紡碳纖維能夠提高葡萄糖氧化酶的吸附性，而活化的碳纖維與尿素反應(yīng)則能增強傳感器的親水性。實驗證明經(jīng)過尿素處理的活性炭纖維的靈敏度比未經(jīng)尿素處理的高 2～3倍，因而在基于活性炭纖維的聚丙烯腈表面引入親水性含氮官能團，可以提高電化學(xué)酶傳感器電極的靈敏度[25]。

石墨烯是一種由碳原子組成的呈蜂巢晶格狀的平面薄膜，將葡萄糖氧化酶與石墨烯共價結(jié)合并固定到聚吡咯修飾的電極表面，組裝的酶傳感器可用來檢測葡萄糖。實驗結(jié)果表明聚吡咯-石墨烯-葡萄糖氧化酶電極的性能明顯優(yōu)于聚吡咯-石墨烯電極[26]。復(fù)位的氧化石墨烯片具有不同的缺陷密度、層面和含氧量，將之修飾到葡萄糖氧化酶電極上可建立一種酶傳感器。通過優(yōu)化和控制石墨烯的結(jié)構(gòu)及其衍生物，這種酶傳感器檢測葡萄糖具有響應(yīng)快、靈敏度高、親和性好等優(yōu)點[27]。

2.2.2 電化學(xué)核酸適體傳感器

核酸適體具有易標(biāo)記、高特異性、高選擇性、小分子量、良好穩(wěn)定性、適用范圍廣等優(yōu)點。近年來，電化學(xué)核酸適體傳感器成為電化學(xué)傳感器研究的熱門課題[28]，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和核酸等小分子的檢測[29-33]。另外，納米材料和探針優(yōu)化可顯著提高核酸適體傳感器的靈敏度與選擇性。

碳納米管能夠促進生物分子與基底電極間的電子轉(zhuǎn)移，在固定生物分子方面有廣闊的應(yīng)用前景。單壁碳納米管具有比表面積大等獨特性質(zhì)，可應(yīng)用于信號增強方面的研究。我們曾提出一種基于單壁碳納米管的傳感信號增強機制，將單壁碳納米管與標(biāo)記有亞甲基藍的單鏈DNA 結(jié)合制備了一種納米生物復(fù)合材料，這種復(fù)合材料作為信號增強平臺可以促進電化學(xué)標(biāo)記與電極間的電子轉(zhuǎn)移(如圖 2)。基于此納米復(fù)合材料的電化學(xué)核酸適體傳感器靈敏度高、線性范圍廣且檢測限低(1.0 pM)，甚至能夠區(qū)分單堿基錯配的 DNA[30]。

圖2 基于單壁碳納米管的電化學(xué)生物傳感器檢測 DNA 示意圖Fig. 2. Scheme of the SWNT-based electrochemical biosensor for nucleic acids detection

附加探針能夠增加游離狀態(tài)的報告探針與電極表面的接觸并促進電子轉(zhuǎn)移。將附著在金電極表面的硫醇化功能捕獲探針、與捕獲探針互補的亞甲基藍修飾的報告探針、以及附著于捕獲探針附近的附加探針三者結(jié)合，構(gòu)建了一種高靈敏度的電化學(xué) DNA 傳感器[32](如圖 3)。該電化學(xué) DNA 傳感器對 DNA 和蛋白質(zhì)的檢測限分別為2.0 pM 和 20.0 pM。這種電化學(xué) DNA 傳感器還可用于檢測其他生物分子，例如 RNA、蛋白質(zhì)與可卡因等小分子。

圖3 電化學(xué) DNA 傳感器檢測 DNA 示意圖Fig. 3. Scheme of the electrochemical DNA biosensor for DNA detection

作為另一種被廣泛應(yīng)用的納米結(jié)構(gòu)材料，金納米粒子具有比表面積大、吸附力強、適用性好以及導(dǎo)電性強等優(yōu)點。DNA 功能化金納米粒子與親和素修飾的電極可構(gòu)成一種信號放大的電化學(xué) DNA 傳感器(如圖 4)，此傳感器靈敏度高、特異性強、檢測方法簡單，可檢測皮摩爾級的目標(biāo)DNA，并且能夠區(qū)分單堿基錯配的單鏈 DNA[33]。

圖4 DNA 功能化金納米粒子傳感器檢測 DNA 示意圖Fig. 4. Scheme of the DNA-functionalized Au nanoparticlebased electrochemical DNA sensor for DNA detection

2.2.3 電化學(xué)免疫傳感器

電化學(xué)免疫傳感器利用抗原和抗體間高特異性結(jié)合所產(chǎn)生的電信號變化對目標(biāo)檢測物進行識別。它具有操作簡單、快速、靈敏、低成本、易集成化和小型化等優(yōu)點，一直備受研究者的關(guān)注[34]。納米材料的應(yīng)用進一步提高了電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度[35]。雙金屬納米多孔結(jié)構(gòu)因其電化學(xué)催化活性高和生物相容性好等優(yōu)勢，在生物傳感方面的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注。一種新型的夾層式無酶電化學(xué)免疫傳感器利用石墨烯作為平臺，雙金屬多孔 PtFe 復(fù)合結(jié)構(gòu)作為抗體信號載體實現(xiàn)信號增強(圖 5)，可用于癌癥標(biāo)志物糖抗原 CA15-3 的檢測。實驗結(jié)果證明這種傳感器精確度高、信號穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景[36]。

圖5 夾層式免疫傳感器組裝過程示意圖Fig. 5. Schematic illustration of the sandwich-type immunosensor fabrication process

SiC 以其高模數(shù)、高強度、良好抗腐蝕和抗氧化性等優(yōu)點已被實際應(yīng)用于催化氧化、光催化反應(yīng)和線性飽和烴的異構(gòu)化等領(lǐng)域。李燦鵬和林潔課題組以 Au @ SiC 納米復(fù)合材料作為電極材料(如圖 6)，鐵氰化物作為介質(zhì)，構(gòu)建了一種新型的無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器，可應(yīng)用于人絨毛膜促性腺激素檢測[37]。這種傳感器的檢測靈敏度可達到 0.042 IU/L。

圖6 無標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器制作過程示意圖Fig. 6. Schematic illustration of the label-free electrochemical immunosensor fabrication process

銀納米粒子/硫堇/無限配位聚合物(AgNP/THI/ICP)纖維不僅有利于抗體的固定，還能促進電子轉(zhuǎn)移。Lu 等[38]利用這些優(yōu)點設(shè)計了一種無標(biāo)記的電化學(xué)免疫傳感器，可應(yīng)用于癌胚抗原的檢測，檢測限可達 0.5 fg/mL。

2.2.4 電化學(xué)微生物傳感器

微生物傳感器的構(gòu)建是通過化學(xué)方法(共價結(jié)合和交叉耦合)或物理方法(吸附和包埋)將微生物固定在傳感器或基底電極上[19]。Toh 課題組通過脂多糖特異性抗體與巰基乙酸修飾的金電極共價結(jié)合構(gòu)建了一種高靈敏電化學(xué)微生物傳感器[39]。這種傳感器在監(jiān)控大腸桿菌的噬菌體感染方面表現(xiàn)出色，所需檢測時間短(5 h)，并且分析過程極其簡單。

2.3 電化學(xué)生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

近年來，隨著生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、納米技術(shù)和新型材料學(xué)等與電化學(xué)技術(shù)的交叉融合，電化學(xué)生物傳感技術(shù)將在生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著更加積極的作用。

2.3.1 基因診斷

基因診斷能夠從分子結(jié)構(gòu)水平和表達水平檢測出基因的異常，從而對疾病做出判斷。電化學(xué)生物傳感器可以直接識別堿基序列并區(qū)別單堿基錯配序列，在基因診斷中得到越來越多的應(yīng)用。

雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法可應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器檢測 DNA 序列。通過雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和三氯化六銨合釕載體構(gòu)造出樹枝狀 DNA 串聯(lián)體以達到增強信號的目的，檢測限可達 5 aM(如圖 7)，這種無酶、無標(biāo)記的新型 DNA 傳感器為基因診斷提供了一種新思路[40]。

Chen 等[41]利用兩條輔助探針雜交串聯(lián)引發(fā)遠程自組裝的機制，構(gòu)建了一種能夠增強信號的一維 DNA 納米復(fù)合結(jié)構(gòu)?；诖?DNA 納米結(jié)構(gòu)的傳感器可用于復(fù)雜生物樣品中的人類免疫缺陷病毒 DNA 超靈敏檢測，檢測限為 5 aM。

圖7 基于樹枝狀 DNA 串聯(lián)體的 DNA 傳感器檢測 DNA 和 ATP 示意圖Fig. 7. Schematic illustration of DNA biosensor fabrication based on dendritic DNA concatamer for detection of target DNA (a)and ATP (b)

MiRNA-24 在細胞增殖和癌細胞分化中起著重要作用。Tang 課題組[42]將與 miRNA 互補的 DNA 探針固定在多壁碳納米管修飾的電極表面，通過監(jiān)測鳥嘌呤的氧化信號測定miRNA-24，檢測限為 1 pM。這種簡單、無標(biāo)記的傳感器還可檢測復(fù)雜 miRNA 樣品中的miRNA-24。

Radecki 課題組建立了雙基因傳感器[43]。這種傳感器將兩條分別修飾有二茂鐵和甲基藍的單鏈 DNA 探針通過 Au-S 鍵固定于金電極表面，通過“信號關(guān)”和“信號開”兩種模式產(chǎn)生兩種分析信號，可同時測定禽流感病毒 H5N1 中血球凝集素的 DNA 序列和神經(jīng)氨酸苷酶的 DNA 序列。

2.3.2 腫瘤標(biāo)志物測定

腫瘤標(biāo)志物的含量與腫瘤的發(fā)生與歸轉(zhuǎn)過程具有密切關(guān)系。電化學(xué)分析是檢測腫瘤標(biāo)志物最有前景的方法之一。

電化學(xué)微流控陣列可用于口腔癌四種蛋白標(biāo)志物的同時測定(如圖 8)。這種電化學(xué)免疫傳感器具有成本低、制作簡單、靈敏度高和選擇性好等優(yōu)點，為口腔癌的診斷和個體化治療提供了一種新方法[44]。

圖8 超靈敏微流控陣列檢測原理示意圖Fig. 8. Strategy for ultra-sensitive detection by microfluidic immunoarray

Jia 等[45]利用氧化銦錫片作為工作電極、石墨烯復(fù)合材料作為支持基質(zhì)構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器可用于癌胚抗原和甲胎蛋白的同時測定。這種免疫傳感器線性范圍廣，檢測限低(癌胚抗原：0.650 pg/mL，甲胎蛋白：0.885 pg/mL)，具有高通量平行分析的潛力。

Wu 等[46]利用復(fù)位氧化石墨烯-四乙烯五胺作為電極材料，氧化還原探針作為標(biāo)記物，建立了一種電化學(xué)免疫傳感器。這種電化學(xué)免疫傳感器可以同時檢測宮頸癌的兩種標(biāo)志物：癌胚抗原和鱗狀細胞癌抗原，具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，對癌胚抗原與鱗狀細胞癌抗原的檢測限分別為0.013 ng/mL 和 0.010 ng/mL。

2.3.3 藥物分析

隨著新型藥物的陸續(xù)研發(fā)，對藥物質(zhì)量的檢查與控制也越來越重要。近年來，電化學(xué)生物傳感器在藥物分析中的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注。

樊春海課題組利用四面體 DNA 納米結(jié)構(gòu)修飾電極表面，構(gòu)建了一種新型的電化學(xué)適體傳感器(如圖 9)。這種電化學(xué)傳感器可用于可卡因的檢測，具有良好的選擇性，檢測底限可達33 nM[47]。

圖9 基于四面體修飾電極的電化學(xué)適體傳感器檢測可卡因原理示意圖Figu. 9. Scheme of electrochemical aptasensor based on tetrahedral-decorated electrode for cocaine detection

另外，多壁碳納米管與石墨絲網(wǎng)印刷電極結(jié)合形成的電化學(xué)傳感器能夠連續(xù) 16 小時監(jiān)測萘普生的實時傳送[48]。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶對抗癌藥物具有耐藥性，將其修飾到碳糊電極上制備出的電化學(xué)生物傳感器可用于抗癌藥物的檢測[49]。

圖10 可用于 H5N1 病毒檢測電化學(xué)生物傳感器原理示意圖Fig. 10. Illustration of the electrochemical biosensor for virus detection

2.3.4 細菌及病毒感染類疾病診斷

細菌及病毒感染是引起人類疾病的主要原因之一。Fu 等[50]利用酶催化反應(yīng)在超低離子強度介質(zhì)中可引起離子強度增加的特性，開發(fā)出一種新型的檢測禽流感病毒 H5N1 的電化學(xué)生物傳感器(圖 10)。這種電化學(xué)生物傳感器在 200 μL 的樣品中檢測限可達到 8×10－4HAU，并且具有制作簡便的優(yōu)點。

Pandey 等[51]利用 1-氯-2-硝基-4-疊氮苯修飾的十八硫醇自組裝單層膜制備的電化學(xué)生物傳感器，夠快速靈敏檢測大腸桿菌，反應(yīng)時間僅需60 s。另外，金納米粒子修飾的氧化銦錫鍍膜玻璃電極可用于固定抗體片段，基于此組裝的電化學(xué)生物傳感器可用于無標(biāo)記檢測人類免疫缺陷病毒 HIV-1[52]。

3 結(jié)語與展望

電化學(xué)生物傳感器開辟了電化學(xué)與分子生物學(xué)研究的新領(lǐng)域，為生命科學(xué)的研究提供了一種全新方法，在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品和藥物分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。近年來隨著各種新材料與新技術(shù)的引進，電化學(xué)生物傳感技術(shù)也得到飛速發(fā)展。然而，當(dāng)前電化學(xué)生物傳感器的研究絕大多數(shù)還處于基礎(chǔ)研究階段，生物識別元件的壽命、穩(wěn)定性及非特異性結(jié)合依舊是其一個大缺陷。此外，在微型化和納米界面的高通量生物傳感應(yīng)用方面仍然缺乏研究，不能完全實現(xiàn)復(fù)雜的生物樣品的實時、快速、超靈敏檢測。因此開發(fā)低成本與集成化的高通量電化學(xué)生物傳感器是當(dāng)前及今后的重點研究方向。納米材料的合成、加工和集成的進步以及其他技術(shù)的引進將會推動電化學(xué)生物傳感器的進一步改善和改進。隨著電化學(xué)生物傳感器多元化的發(fā)展與新技術(shù)的不斷成熟，電化學(xué)生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)⒕哂懈鼜V闊的應(yīng)用前景。

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