王忠中，張 萍，石彥鵬

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司，銀川750101)

抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中，菌種的發(fā)酵水平是提高產(chǎn)能的至關(guān)重要的因素，而菌種的發(fā)酵水平可通過大量的篩選、誘變、基因工程手段進(jìn)行提高［1］。所以，各生產(chǎn)企業(yè)、研究機(jī)構(gòu)都在菌種篩選誘變方面進(jìn)行大量的研究和開發(fā)，并取得很好的效果。越來越多的技術(shù)被應(yīng)用到菌種選育當(dāng)中［2］。但傳統(tǒng)的方法由于多次重復(fù)使用導(dǎo)致誘變效果不明顯，而一些新技術(shù)條件苛刻、費(fèi)用昂貴，很難在工業(yè)生產(chǎn)中普及。

常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma，簡稱ARTP)是近幾年來發(fā)展起來的一種等離子體源，能夠在大氣壓下產(chǎn)生溫度在25～40℃之間的、具有高活性粒子(包括處于激發(fā)態(tài)的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)濃度的等離子體射流［3］?？茖W(xué)研究表明，等離子體中的活性粒子作用于微生物，能夠使微生物細(xì)胞表面電勢下降;改變細(xì)胞壁/膜的結(jié)構(gòu)及通透性;能夠?qū)?植株/細(xì)胞等的遺傳物質(zhì)造成損傷，并誘發(fā)生物細(xì)胞啟動(dòng)SOS修復(fù)機(jī)制，進(jìn)而使微生物基因序列及其代謝網(wǎng)絡(luò)顯著變化，最終導(dǎo)致微生物產(chǎn)生突變，已在生物誘變中廣泛應(yīng)用［4－5］。

本文利用氦氣源ARTP分別對弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)和側(cè)耳屬(Pleurotus sp.)進(jìn)行了不同時(shí)間的照射，統(tǒng)計(jì)死亡率，并對誘變后的菌株進(jìn)行篩選，確定了ARTP對兩種不同微生物的最佳照射時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 泰樂菌素產(chǎn)生菌弗氏鏈霉菌，編號12－662，斜面孢子;泰妙菌素生產(chǎn)菌側(cè)耳屬，編號12－142，斜面菌絲。兩菌種由寧夏泰瑞制藥股份有限公司種子室保存。

1.1.2 主要設(shè)備 室溫常壓等離子體誘變系統(tǒng)(ARTP)，北京思清源生物科技有限公司;旋轉(zhuǎn)搖瓶機(jī)，XDW25/96型，四川長征制藥機(jī)械廠;紫外可見分光光度計(jì)，UV1800、高效;液相色譜儀，日本島津公司;恒溫、凈化工作系統(tǒng)。

1.1.3 試劑及原料

1.1.3.1 氦氣，純度 99.99%;麩皮，自制;葡萄糖、氯化鈷、磷酸氫二銨、硫酸鎳、硫酸鋅、氯化鎂等均為分析純，魚蛋白胨、酵母膏為北京奧博星生物試劑公司;玉米漿、豆餅粉、魚粉、玉米粉、玉米蛋白粉為本地農(nóng)副產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將弗氏鏈霉菌斜面孢子用無菌水洗下?lián)u勻，制備成孢子懸液。將側(cè)耳屬斜面菌絲鏟下移入組織研磨器中，加入無菌水研磨均勻［6］。

1.2.2 照射菌膜制備 分別取制備好的菌懸液1滴，加到專用不銹鋼片上，涂均勻，在無菌條件下干燥形成菌膜。

1.2.3 等離子誘變 開啟ARTP誘變系統(tǒng)，調(diào)整氦氣供氣壓力在0.1～0.2 MPa，設(shè)定入射氣流為8.0 SLM，功率為140 W，將載有菌膜的鋼片放入誘變系統(tǒng)操作室，調(diào)整至發(fā)射口正下方，距發(fā)射口2 mm，照射時(shí)間由20 s到400 s遞增。由于弗氏鏈霉菌是用孢子懸液進(jìn)行誘變，抵抗能力強(qiáng)，誘變時(shí)間從120 s開始，以30 s間距遞增;側(cè)耳屬是菌絲片段進(jìn)行誘變，抵抗力弱且不耐長時(shí)間干燥，誘變時(shí)間從20 s開始，以5 s間距遞增。每組設(shè)兩個(gè)鋼片，將照射后的菌膜置同一試管制備菌懸液。同時(shí)以不照射的兩個(gè)載有菌膜的鋼片為對照組。

1.2.4 誘變菌株的分離與培養(yǎng) 將照射后的及對照組鋼片分別置于滅菌試管中，加入1 mL無菌生理鹽水劇烈震蕩，洗下菌膜并搖勻，按10倍稀釋法稀釋至10－5倍，每個(gè)稀釋度取0.1 mL涂布接種平板5個(gè)。置培養(yǎng)箱中按照寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)控制工藝培養(yǎng)形成單菌落［6－7］。

1.2.5 單菌落的挑取和死亡率計(jì)算 待單菌落培養(yǎng)好后，選擇挑取典型形態(tài)的單菌落進(jìn)行擴(kuò)培和篩選，并對平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)算每組平均菌落數(shù)相對于對照組的死亡率。

1.2.6 搖瓶篩選 將擴(kuò)培后的單菌落斜面挖塊接入發(fā)酵瓶中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵初篩，同時(shí)以原誘變前斜面做對照，發(fā)酵結(jié)束測定發(fā)酵液效價(jià)，泰樂菌素發(fā)酵液用分光光度計(jì)法，泰妙菌素發(fā)酵液用高效液相色譜法。根據(jù)初篩結(jié)果挑選高效價(jià)菌株進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩采用二級發(fā)酵，即將斜面挖塊接種到種子瓶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)成熟后按10%接種量將種子液接入發(fā)酵瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。每個(gè)單菌落斜面接1個(gè)種子瓶，每個(gè)種子瓶平行接3個(gè)發(fā)酵瓶，同時(shí)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。

1.2.7 傳代穩(wěn)定性考察 經(jīng)過復(fù)篩高于對照的菌株進(jìn)行傳代考察穩(wěn)定性，每個(gè)菌株三代，分別用F0、F1、F2、F3表示原種、一代、二代、三代。每代斜面接1個(gè)種子瓶，每個(gè)種子瓶平行接5個(gè)發(fā)酵瓶，同時(shí)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以F0代效價(jià)為對照，考察各代斜面平均效價(jià)和均勻情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 死亡率與照射時(shí)間的關(guān)系 結(jié)果見圖1。

圖1 死亡率與照射時(shí)間關(guān)系圖

從圖1可以看出，不同菌種對等離子的耐受情況明顯不同，弗氏鏈霉菌在150 s以內(nèi)死亡率不足30%，150 s以后死亡率迅速上升，270 s時(shí)達(dá)92.8%;而側(cè)耳屬在20 s時(shí)死亡率已達(dá)70%以上并隨著照射時(shí)間的增加迅速上升，35 s達(dá)95%以上，40 s以后全部死亡。

2.2 誘變菌株初篩結(jié)果 兩種菌在誘變后其菌落形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化，而菌落大小與菌落多少有關(guān)，不能直接從菌落形態(tài)觀察變異情況。分別從誘變后的平板中挑取100株菌落擴(kuò)培成斜面進(jìn)行初篩。弗氏鏈霉菌210 s以前各組平板中菌落比較密、比較小，無法挑取單個(gè)菌落，故未進(jìn)行篩選。初篩結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表1，相對效價(jià)見圖2。

表1 誘變菌株的初篩結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖2 初篩效價(jià)與照射時(shí)間關(guān)系圖

從初篩結(jié)果看，高效價(jià)比例(正變率)較高的照射時(shí)間段其誘變死亡率并不是很高，集中在80%～90%，弗氏鏈霉菌和側(cè)耳屬兩種菌基本接近，對應(yīng)照射時(shí)間分別為240～270 s和25～30 s;同時(shí)在該照射時(shí)間段下，正突變菌株初篩效價(jià)高于對照的幅度較大，大多數(shù)超過5%，有明顯趨勢，說明等離子誘變中，死亡率太高反而不利于菌種正突變。

2.3 誘變株復(fù)篩結(jié)果 分別將初篩中高于對照的菌株接入發(fā)酵瓶進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，結(jié)果見表2和表3。

表2 弗氏鏈霉菌誘變株復(fù)篩效價(jià)結(jié)果 u/mL

表3 側(cè)耳屬誘變株復(fù)篩效價(jià)結(jié)果 u/mL

表2 結(jié)果顯示，弗氏鏈霉菌270 s照射組選出的62號菌株復(fù)篩效價(jià)高于對照10.4%;表3結(jié)果顯示，側(cè)耳屬25 s照射組選出的28號菌株復(fù)篩效價(jià)高于對照9.6%。

2.4 穩(wěn)定性考察結(jié)果 分別將弗氏鏈霉菌62號菌株和側(cè)耳屬28號菌株傳三代培養(yǎng)成斜面，接入發(fā)酵瓶進(jìn)行穩(wěn)定性考察，結(jié)果見表4。

表4 篩選株傳代穩(wěn)定性考察

表4 穩(wěn)定性結(jié)果顯示，弗氏鏈霉菌隨著代次增加，發(fā)酵能力逐漸減低，F(xiàn)3代斜面效價(jià)低于 F0代4.9%，整體穩(wěn)定性較好。側(cè)耳屬在F1代時(shí)，效價(jià)明顯高于F0代，但到F2代后迅速降低，低于F0代，三代內(nèi)最大差異3.9%。

3 討論

3.1 從死亡率分析，不同菌種的耐受程度有較大區(qū)別，與菌種特性有關(guān)，弗氏鏈霉菌為放線菌，其孢子耐受能力強(qiáng)，而側(cè)耳屬為不產(chǎn)孢子擔(dān)子菌，菌絲較脆弱，隨著作用時(shí)間的延長，很快死亡。但利用ARTP誘變菌種，死亡率曲線相對較為平緩，有利于誘變功率和作用時(shí)間的掌握。

3.2 在制備菌膜時(shí)不可使用生理鹽水，以免干燥后無機(jī)鹽晶體析出，誘變時(shí)飛濺和導(dǎo)電。

3.3 該方法離子源能量穩(wěn)定，誘變過程中溫度維持在40℃以內(nèi)，可有效防止菌種因高溫死亡或部分對溫度敏感的功能蛋白變性。

3.4 ARTP相對于其他物理化學(xué)誘變手段，主要優(yōu)勢體現(xiàn)在誘變過程不產(chǎn)生有毒有害廢物，危險(xiǎn)性小，誘變株培養(yǎng)不需要特殊防護(hù)［1］;與重離子束注入法相比，該方法操作簡便，不需要大型粒子加速器裝置，普通實(shí)驗(yàn)室即可開展［8］;也不需要航天育種那樣受限制［9］，在生物育種方面有較好的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)采用ARTP技術(shù)進(jìn)行誘變，弗氏鏈霉菌誘菌株復(fù)篩效價(jià)高于對照的占復(fù)篩數(shù)的47%，最高效價(jià)高于對照10.4%;側(cè)耳屬復(fù)篩效價(jià)高于對照的占復(fù)篩數(shù)的33%，最高效價(jià)高于對照9.6%，表明該方法誘變菌種有較好的效果。試驗(yàn)最終確定弗氏鏈霉菌和側(cè)耳屬誘變的最佳照射時(shí)間分別為240～270 s和25～30 s。

［1］施巧琴，吳松剛.工業(yè)微生物育種學(xué)［M］.北京:科學(xué)出版社，2003.

［2］陳德剛，牛 春，沈曉鴻，等.重離子注入法誘變維生素B12高產(chǎn)菌株［J］.中國獸藥雜志，2012，46(2):39－41.

［3］王立言.常壓室溫等離子體對微生物的作用機(jī)理及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究［D］.北京:清華大學(xué)，2010.

［4］金麗華，方明月，張 種，等.常壓室溫等離子體快速誘變產(chǎn)油酵母的條件及其突變株的特性［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2011，27(3):461－467.

［5］汪 晨，蔡 恒，張恒麗，等.高產(chǎn)琥珀酸菌株的等離子體誘變選育［J］.南京大學(xué)工業(yè)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2013，35(1):57 －60.

［6］馬繼花，張 萍，石彥鵬，等.馬玲薯葡萄糖培養(yǎng)基在延胡索酸泰妙菌素菌種選育中的應(yīng)用［J］.中國獸藥雜志，2012，46(12):54－56，66.

［7］石彥鵬，張 麗，張 萍.硫酸亞鐵對泰樂菌素發(fā)酵的影響［J］.中國獸藥雜志，2009，43(6):30－31.

［8］李明仁，王菊芳，李文建.重離子束在微生物誘變育種及生物能源開發(fā)中的應(yīng)用［J］.原子核物理評論［J］.2007，24(3):234－237.

［9］方曉梅，趙志甲，顧?？?泰樂菌素產(chǎn)生菌的空間誘變育種研究［J］.航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2005，補(bǔ)充卷(期)號:121－125