宮語晨，許崇利，錢愛東*，許崇波

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118;2.吉林化工學(xué)院化工與生物技術(shù)學(xué)院，吉林吉林132022;3.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連116622)

A型魏氏梭菌(Clostridium welchii type A)是引起人畜創(chuàng)傷性氣性壞疽的主要病原菌之一，該菌主要致病因子是α毒素。α毒素是由370個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，是一種依賴于鋅離子具有磷脂酶C(PLC)活性的金屬酶，它能水解細(xì)胞膜的磷脂酰膽堿，破壞細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致細(xì)胞裂解，從而具有細(xì)胞毒性、溶血性、致死性和皮膚壞死性等特性［1-3］。α毒素具有酶分子的結(jié)構(gòu)特征，其活性部位包括催化位點(diǎn)和結(jié)合位點(diǎn)。α毒素的第56位天冬氨酸(Asp-56)是鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)，又是α毒素的磷脂酶C催化位點(diǎn)，α毒素Asp-56對其具有生物學(xué)活性至關(guān)重要［4-6］。但關(guān)于α毒素Asp-56突變前后的生物學(xué)活性和分子結(jié)構(gòu)的變化以及二者之間的關(guān)系尚不清楚。為此，本實(shí)驗(yàn)選擇影響α毒素磷脂酶C活性第56位Asp-56進(jìn)行定點(diǎn)突變，開展α毒素Asp-56突變前后分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的研究，為今后研究α毒素分子結(jié)構(gòu)對其生物學(xué)活性的影響以及α毒素的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為下一步研制α毒素基因工程亞單位疫苗提供候選工程菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體、菌種和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 表達(dá)載體pET-32a和受體菌E.coli BL21(DE3)均購自Novagen公司;含α毒素基因的重組質(zhì)粒pXETA02由大連大學(xué)許崇波教授惠贈［7］;昆明系小鼠購自吉林大學(xué)農(nóng)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，16～18 g，雌雄各半。

1.1.2 試劑 Ex Taq PCR試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶 (BamH I、EcoR I、Nco I)、QDL2000 DNA Marker和IPTG均購自寶生物工程(大連)有限公司;Wizard PCR preps DNA Purification System、T4DNA連接酶購自Promega公司;瓊脂糖為Biowest公司產(chǎn)品;卡那霉素、氨芐青霉素購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 α毒素D56G突變體基因PCR引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)A型魏氏梭菌α毒素基因序列［8］，設(shè)計(jì)α毒素D56G突變體基因PCR引物:引物P1:5’-CATGCCATGGCAATGAAAAGAAAGATTTGT-3’，引物 P2:5’-TGGATAAG TAGAACCTAATTG-3’，引物 P3:5’-GGTTATGATAAGAATGCATAT-3’(突變引物)，引物 P4:5’-CCGGAATTCTTTTATATTATAAGTTGAATT-3’，引物 P1含有 Nco I限制性內(nèi)切核酸酶堿基(斜體部分)和保護(hù)性堿基，引物P4含有EcoR I限制性內(nèi)切核酸酶堿基(斜體部分)和保護(hù)性堿基，引物P3為含有突變堿基的突變引物，PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

PCR 體 系 (50 μL):10 × PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，模板pXETA02 DNA 1 μL，引物 P1 和 P2(0.1 μmol/L)各1 μL，ddH2O 36 μL，Ex Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL。

PCR條件:95℃ 5 min;95℃ 60 s，55℃ 60 s，72℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。

1.2.2 α毒素D56G基因的定點(diǎn)突變與重組表達(dá)質(zhì)粒pM-D56G的構(gòu)建 用引物P1和P2從模板pXETA02質(zhì)粒中擴(kuò)增0.26 kb基因片段，再用引物P3和P4從模板pXETA02質(zhì)粒中擴(kuò)增0.94 kb基因片段，回收二者的PCR片段，用T4DNA連接酶連接，然后以連接產(chǎn)物為模板，用引物P1和P4再進(jìn)行擴(kuò)增，即可得到帶有突變位點(diǎn)的1.2 kb α毒素D56G突變體基因，最后進(jìn)行酶切鑒定和核苷酸序列測定［9］。

1.2.3 重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及包涵體變性與復(fù)性 參照文獻(xiàn)［10-11］，將 250 mL 重組菌株 BL21(DE3)(pMD56G)培養(yǎng)液在4℃于7000 r/min離心10 min，棄掉上清的菌體，用 50 mL緩沖液［20 moL/L Tris-HCl(pH 8.0)］懸浮混勻，在4℃于7000 r/min離心10 min。重復(fù)洗滌菌體一次。用300 mL緩沖液［1 moL/L Tris-HCl(pH 8.0)］懸浮混勻菌體，然后于冰水浴中進(jìn)行超聲波破碎。超聲波破碎菌體的條件是:功率400 W，超聲5 s，間歇5 s，共45 min。超聲波破碎菌體結(jié)束后，在4℃ 10000 r/min離心30 min，棄掉上清的沉淀物用洗滌液［20 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.5 moL/L尿素］懸浮混勻。重復(fù)洗滌沉淀物一次，再用500 mL洗滌液重懸沉淀，所得產(chǎn)物即為包涵體。

按照變性液與包涵體1∶40的比例，加入變性液［20 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)，8 moL/L 尿素，0.1% β-巰基乙醇］，迅速重懸包涵體，于37℃ 變性2 h，然后在4℃ 12000 r/min離心10 min。把上清液移入處理過的透析袋并密封后，放進(jìn)已加入150 mL復(fù)性液［20 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)，尿素濃度梯度分別為 6、4、2、0 moL/L］的燒杯中開始進(jìn)行梯度透析復(fù)性。間隔6 h更換一次復(fù)性液，復(fù)性后的包涵體蛋白放入離心管中，4℃保存?zhèn)溆茫?0-11］。包涵體蛋白的SDS-PAGE分析按文獻(xiàn)［9］介紹的方法進(jìn)行。

1.2.4 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測 按照Geourjon介紹的SOPMA法，在EXPASY服務(wù)器(http://www.expasy.org/tools)進(jìn)行預(yù)測α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)［12］。

1.2.5 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子3D結(jié)構(gòu)的預(yù)測 以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)解析的A型魏氏梭菌α毒素的三維結(jié)晶結(jié)構(gòu)(3D)為模板，利用EXPASY服務(wù)器(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)同源模型構(gòu)建α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子的3D結(jié)構(gòu)，并用Rasmol分析軟件繪制其3D結(jié)構(gòu)圖［13］。

1.2.6 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白圓二色光譜分析 采用J810-150S型圓二色(CD)光譜儀，在25℃恒溫下，將0.6 mL蛋白溶液(10 μmol/L)置于光徑為0.1 cm比色杯中，掃描范圍190～250 nm，狹縫寬度1 nm，掃描速度50 nm/min，響應(yīng)時(shí)間2 s，掃描次數(shù)3次。測定α毒素和α毒素D56G突變體蛋白的CD光譜并記錄數(shù)據(jù)［10］。

1.2.7 重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)生物學(xué)活性的測定 將構(gòu)建的重組菌株(BL21(DE3)(pMD56G)培養(yǎng)上清、菌體、菌體裂解物和A型魏氏梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C57-1的培養(yǎng)上清分別接種卵黃瓊脂平板和血瓊脂平板上，觀察有無磷脂酶C活性和溶血活性［14］。另外，取 3 只 0.5 mL Eppendorf管，各加入100 μL卵黃(含卵磷脂)稀釋液，再分別加入100 μL α毒素、α毒素D56G突變體蛋白、生理鹽水，混勻后，于37℃孵育24 h，觀察是否有渾濁環(huán)出現(xiàn)，檢測磷脂酶C活性［10］。

取80只小鼠，隨機(jī)分組，每組20只，分別經(jīng)口服或腹腔注射5×109個(gè)A型魏氏梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C57-1和重組菌株(BL21(DE3)(pM-D56G)，觀察癥狀和病理變化［14］。

1.2.8 抗原制備及免疫攻毒試驗(yàn) 重組菌株(BL21(DE3)(pM-D56G)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后離心收集菌體，然后重懸于5 mL 50 mmol/L Tris-HCl-2 mmol/L EDTA中，加入溶菌酶至終濃度100 μg/mL，再加入5 mL 1%TritonX-100，于30℃溫育15 min。超聲波處理2個(gè)10 s，然后12000 r/min離心15 min，收集的沉淀物即為包涵體粗提物，將其10倍稀釋后，加入氫氧化鋁膠至10%，作為免疫用抗原［14］。

取160只小鼠，隨機(jī)分為2組，每組80只，一組用包涵體抗原腹腔免疫0.5 mL/只，另一組用A型魏氏梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C57-1類毒素0.5 mL/只，間隔14 d后，以上述方法進(jìn)行第二次免疫，14 d后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。同時(shí)設(shè)立生理鹽水對照組。將過夜培養(yǎng)的A型魏氏梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌C57-1培養(yǎng)上清作倍比稀釋，每個(gè)劑量腹腔注射小鼠6只，觀察小鼠死亡情況;用1MLD A型魏氏梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C57-1培養(yǎng)上清攻擊免疫小鼠，觀察小鼠存活情況［14］。

2 結(jié)果與分析

2.1 α毒素D56G突變基因的擴(kuò)增與表達(dá)質(zhì)粒pMD56G的構(gòu)建 利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，擴(kuò)增出帶有突變位點(diǎn)的1.2 kb A型魏氏梭菌α毒素D56G突變體基因，并將其插入到表達(dá)載體pET-32a上，構(gòu)建了含α毒素D56G突變基因表達(dá)質(zhì)粒的重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)。經(jīng)Nco I/EcoR I、BamH I/EcoR I和Nco I/BamH I/EcoR I酶切鑒定和序列測定，結(jié)果表明，構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pMD56G含有α毒素D56G突變體基因(圖1)，而且編碼α毒素第56位Asp的密碼子GAT已經(jīng)突變成編碼Gly的密碼子GGT，成功地構(gòu)建了α毒素D56G突變體基因并準(zhǔn)確實(shí)施了預(yù)期的定點(diǎn)突變。

2.2 α毒素D56G突變體基因表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE分析 含A型魏氏梭菌α毒素D56G突變體基因的重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)用IPTG誘導(dǎo)4 h后，SDS-PAGE分析結(jié)果表明，α毒素D56G突變體基因在受體菌BL21(DE3)中得到較高水平的表達(dá)。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)中的α毒素D56G突變體蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白相對含量的22.48%(圖2)。

圖2 重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

2.3 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果顯示，α毒素蛋白含α螺旋118個(gè) (31.9%)、β折疊78個(gè) (21.1%)、β轉(zhuǎn)角44個(gè) (11.9%)、無規(guī)則卷曲130個(gè) (35.1%)，α毒素D56G突變體含α螺旋118個(gè) (31.89%)、β折疊78個(gè) (21.08%)、β轉(zhuǎn)角46個(gè) (12.43%)、無規(guī)則卷曲128個(gè) (34.60%)(圖3)。從預(yù)測的α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)結(jié)果來看，二者的二級結(jié)構(gòu)除第56突變位點(diǎn)由無規(guī)則卷曲變成β轉(zhuǎn)角和第55位由無規(guī)則卷曲變成β轉(zhuǎn)角外，其余的二級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化，說明α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)基本一致。

2.4 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子3D結(jié)構(gòu)預(yù)測 α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子3D結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果顯示，α毒素一共有10段α螺旋，8段β折疊，而α毒素D56G突變體蛋白的3D結(jié)構(gòu)與α毒素的3D結(jié)構(gòu)相似(圖4)。

2.5 α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子的圓二色光譜分析 圓二色(CD)光譜儀測定了α毒素及α毒素D56G突變體蛋白分子的CD光譜，結(jié)果顯示，α毒素分別在207 nm和209 nm處有一個(gè)凹峰，而α毒素D56G突變體蛋白則沒有(圖5 A、B，表1)。

圖3 α毒素和α毒素D56G突變體蛋白分子的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及比較

圖4 α毒素(A)和α毒素D56G突變體蛋白(B)分子3D結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 α毒素(A)及α毒素D56G突變體蛋白(B)的圓二色譜圖

表1 圓二色譜測定α毒素和α毒素D56G突變體蛋白二級結(jié)構(gòu)成分比較

2.6 重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)生物學(xué)活性的測定 將重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)的培養(yǎng)上清、菌體培養(yǎng)物及菌體裂解物涂布于卵黃瓊脂平板上，結(jié)果重組菌株的培養(yǎng)上清、菌體培養(yǎng)物、菌體裂解物均沒有出現(xiàn)渾濁環(huán)，表明α毒素D56G突變體蛋白沒有磷脂酶C活性，而對照組的A型魏氏梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C57-1培養(yǎng)上清在卵黃瓊脂平板上出現(xiàn)了渾濁環(huán)，這說明重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)不具備α毒素的磷脂酶C活性。磷脂酶C活性檢測結(jié)果如圖6所示:1號管出現(xiàn)渾濁環(huán)，而2號和3號管均未出現(xiàn)渾濁環(huán)。結(jié)果說明2號管α毒素D56G突變體蛋白和3號管生理鹽水均不能分解卵黃中的卵磷脂，故不具有磷脂酶C活性;1號管α毒素出現(xiàn)渾濁環(huán)，說明α毒素能分解卵黃中的卵磷脂，具有磷脂酶C活性。上述試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)表達(dá)的α毒素D56G突變體蛋白已經(jīng)喪失了α毒素的磷脂酶C活性。

圖6 磷脂酶C活性檢測結(jié)果

將重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)的培養(yǎng)上清、菌體培養(yǎng)物、菌體裂解物涂布于血瓊脂平板上，結(jié)果重組菌株的培養(yǎng)上清、菌體培養(yǎng)物、菌體裂解物均沒有出現(xiàn)溶血環(huán)，表明α毒素D56G突變體蛋白沒有溶血作用，而陽性對照組的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C57-1培養(yǎng)上清在血瓊脂平板上出現(xiàn)了溶血環(huán)，陰性對照組的BL21(DE3)(pET-32a)培養(yǎng)上清在血瓊脂平板上沒有出現(xiàn)溶血環(huán)，這說明重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)不具備α毒素的溶血活性。另外，經(jīng)腹腔注射或口服兩種途徑接種重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)3周后，小鼠全部存活且無異常表現(xiàn)，剖檢觀察無病理變化，表明該菌株喪失了α毒素毒性和致病性;而A型魏氏梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C57-1陽性對照組則出現(xiàn)典型的臨床癥狀和病理變化，BL21(DE3)(pET-32a)陰性對照組則無任何變化。

2.7 免疫攻毒試驗(yàn) 免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，重組菌株BL21(DE3)(pM-D56G)包涵體抗原免疫組保護(hù)率為92.5%(74/80)，A型魏氏梭菌標(biāo)準(zhǔn)株C57-1類毒素抗原免疫組保護(hù)率為95%(76/80)，而生理鹽水對照組20只小鼠全部死亡，這說明構(gòu)建的α毒素D56G突變體蛋白具有較好的免疫保護(hù)效果。

3 討論

A型魏氏梭菌的主要致病因子是菌體產(chǎn)生的α毒素，由于α毒素能水解卵磷脂的C鏈，產(chǎn)生磷酰膽堿和甘油二脂，故又稱為磷脂酶C(Phospholipase C，PLC)。

α毒素的某些氨基酸組成對其生物學(xué)活性有著重要的影響，其中個(gè)別氨基酸對其生物活性起著十分重要作用。Nagaham等［15］利用定點(diǎn)突變技術(shù)，研究了組氨酸殘基在α毒素中的作用，他們將第68位組氨酸殘基(His)突變成甘氨酸殘基(Gly)，結(jié)果突變的α毒素完全喪失了α毒素本身的磷脂酶C活性、鞘磷脂酶活性和溶血活性。如果將第126位、136位His突變成Gly，結(jié)果突變的α毒素活性比天然α毒素活性下降100倍。Guillouard等［16］將α毒素第56位Asp突變成 Asn，Nagahama等［17］將第56 位的 Asp 突變成 Ser、Asn、Glu 或 Gln，結(jié)果都證實(shí)這些α毒素突變體完全喪失了α毒素的溶血性和PLC活性。研究還表明，第56位的Asp是α毒素活性的催化位點(diǎn)，第130位Asn是α毒素活性的結(jié)合位點(diǎn)。另外該研究小組還研究了α毒素氨基端酶活位點(diǎn)附近57和65位Tyr的作用，將以上位點(diǎn)用Ala、Leu或Phe突變后，沒有影響鞘磷脂酶的活性。然而將兩個(gè)突變體毒素結(jié)合到脂質(zhì)體上，并用環(huán)境敏感熒光基團(tuán)標(biāo)記后追蹤，發(fā)現(xiàn)其存在于雙分子層疏水區(qū)，說明第57位和第65位的Tyr在α毒素滲透進(jìn)雙分子膜和鞘磷脂催化位點(diǎn)過程中起著重要作用，但不參與酶活反應(yīng)［18］。上述研究都說明α毒素的某些氨基酸殘基對其生物學(xué)活性至關(guān)重要，但都尚未開展α毒素突變體分子結(jié)構(gòu)的研究。

本研究選擇α毒素磷脂酶C上鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)第56位天冬氨酸(Asp-56)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建了在大腸桿菌中較高水平表達(dá)的α毒素D56G突變體基因，并測定了α毒素D56G突變體蛋白的二級結(jié)構(gòu)、3D結(jié)構(gòu)和圓二色(CD)光譜，同時(shí)檢測了其生物學(xué)活性，進(jìn)而探討了α毒素突變前后分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的變化，結(jié)果表明突變前后α毒素的二級結(jié)構(gòu)和CD光譜都發(fā)生了變化，但卻具有免疫原性，這為進(jìn)一步研究α毒素的分子結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為下一步研制α毒素基因工程亞單位疫苗提供了候選基因工程菌株。

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