劉居萍，喬 軍，葛陽(yáng)春

（1.新疆石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆庫(kù)車縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 庫(kù)車 842000）

豬圓環(huán)病毒病(PCVD)是由豬圓環(huán)病毒(PCV)引起的一種多系統(tǒng)功能障礙性疾病，導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制。圓環(huán)病毒屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，是所有已知?jiǎng)游锊《局凶钚〉牟《玖Ｗ?，為單股環(huán)狀DNA病毒。基因組由一個(gè)單股環(huán)狀組成，基因組全長(zhǎng)一般為1 766～1 768 nt。PCV-2根據(jù)基因組遺傳距離的大小可以劃分為3個(gè)基因型，分別為PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c，其中PCV-2c基因型僅在丹麥有發(fā)現(xiàn)[1]。臨床上主要病癥以新生仔豬先天性腦震顫和斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)最為常見(jiàn)，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難，消瘦，體表淋巴結(jié)腫大，腹瀉，黃疸，貧血，甚至死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。豬圓環(huán)病毒分為2個(gè)血清型，PCV-1和PCV-2。其中PCV-1不引起臨床癥狀，廣泛存在于正常豬體各器官組織及豬源細(xì)胞。PCV-2對(duì)各種年齡的家豬和野豬均有致病性，目前認(rèn)為PCV-2在世界各地到處都存在，無(wú)論是否發(fā)生PCVD，是近年來(lái)獸醫(yī)界引人注目的一種新的豬傳染病。自從1991年加拿大首次報(bào)道了PCV-2是PMWS的主要病原以來(lái)[2]，其在世界各地迅速蔓延。我國(guó)也于2000年檢測(cè)到了該病毒的存在[3]，該病毒在我國(guó)豬群的感染率近乎50%，給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)也造成了嚴(yán)重的損失。

PMWS既可水平傳播，導(dǎo)致斷奶仔豬發(fā)病死亡，亦可垂直傳播，引起繁殖障礙。PCV-2主要侵害免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致感染豬免疫抑制，降低機(jī)體對(duì)其他病原體的抵抗力和疫苗的反應(yīng)性，可導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，容易導(dǎo)致其他病毒和細(xì)菌的繼發(fā)感染，使死亡率明顯升高。近年來(lái)，隨著庫(kù)車縣養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，一些養(yǎng)豬場(chǎng)從外地引入種豬。伴隨在引種的同時(shí)，一些新的豬病也帶入本縣。近兩年，發(fā)現(xiàn)養(yǎng)豬場(chǎng)每年疑似豬圓環(huán)病毒病的病例不斷增加，為了了解庫(kù)車縣豬圓環(huán)病毒病流行情況，筆者于2012年8月至2012年12月在全縣6個(gè)區(qū)域的32個(gè)豬場(chǎng)隨機(jī)抽取443份血清樣品，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)了PCV-2抗體陽(yáng)性率。通過(guò)對(duì)不同豬場(chǎng)不同生產(chǎn)階段豬群PCV-2血清流行病學(xué)研究，分析PCV-2在我縣不同豬場(chǎng)和不同生產(chǎn)階段豬PCV-2的感染狀況。為進(jìn)一步證實(shí)該病在我縣的存在，對(duì)可疑死亡生豬的病料組織進(jìn)行了豬2型圓環(huán)病毒全基因組的克隆、測(cè)序分析，不但為該病積累了流行病學(xué)資料，而且也為我縣對(duì)該病的科學(xué)防控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品和病料組織 選擇庫(kù)車縣部分有代表性的養(yǎng)豬場(chǎng)32個(gè)，隨機(jī)采樣。按相關(guān)的生物安全要求進(jìn)行無(wú)菌采血，分離血清備用，并對(duì)豬的日齡、防疫情況以及臨床健康狀況作詳細(xì)記錄。共采集443份血清。將庫(kù)車縣豬場(chǎng)疑似PCV-2感染的發(fā)病豬采集的淋巴結(jié)、脾臟、肺臟及肝臟等組織，共采集18頭病豬病料，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 豬圓環(huán)病毒病酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)診斷試劑盒(北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司)，試劑生產(chǎn)批號(hào)：PCV20120618E。Taq plus DNA聚合酶、dNTPs、瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒，購(gòu)自北京諾維森生物科技有限公司。pMD18-T載體，購(gòu)自大連TaKaRa公司。病毒基因組提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司、Marker2000，購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司。

1.3 PCV-2引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)DNAMAN生物軟件針對(duì)PCV-2基因設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增長(zhǎng)度為982 bp，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列 PCV-N1：5'-ACCAGCGCACTTCGGCAGCG-3'；PCV-N2：5'-TCATATGGAAATTCAGGGCA-3'。PCVN3：5'-TTACCAGCAATCAGACCCCG-3'；PCV-N4：5'AATACTTACAGCGCACTTCT 3'。

1.4 ELISA檢測(cè)血清PCV-2抗體 依照豬圓環(huán)病毒病酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)診斷試劑盒操作說(shuō)明步驟進(jìn)行，洗滌液20倍稀釋配制、樣品1∶5的體積稀釋、加樣、封膜、孵育、洗版、加底物、加終止液。按照被檢樣品OD450值＜臨界值，為PCV-2抗體陰性；被檢樣品OD450值≥臨界值，為PCV-2抗體陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.5 病料DNA提取 用天根生化科技(北京)有限公司提供的DVA病毒基因組提取試劑盒方法提取病料中的DNA，試劑盒里有緩沖液GB、漂洗液RW、蛋白酶K、吸附柱、收集管、ddH2O等。將病豬的病料5 g左右用1～1.5 mL生理鹽水研磨，研磨約5 min，研磨后液體放入1.5 mL EP管中，12 000 r/min離心5 min，取上清液。按照組織/細(xì)胞DNA抽提試劑盒的操作說(shuō)明提取總DNA。

1.6 樣品中PCV-2的檢測(cè) 通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增條件和反應(yīng)程序的優(yōu)化，確定方案如下：取提取的DNA為模板4 μL，引物PCV-N1（25 pmol/μL）、PCV-N2（25 pmol/μL）各 1μL，PCR Mix 10 μL，水 6 μL，混勻。PCR采用20 μL的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性50s，51℃退火40s，72℃延伸1 min 20s，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸l0 min；4℃無(wú)限延伸。PCR反應(yīng)進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增反應(yīng)完成后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在l%瓊脂糖凝膠中，以0.5×TAE緩沖液，120 V電壓電泳30 min，溴化乙錠染色。電泳結(jié)束后，在紫外線下觀察，記錄結(jié)果并拍照保存。

1.7 陽(yáng)性樣品PCV-2全序列的擴(kuò)增與克隆 在鑒定為PCV-2陽(yáng)性的樣品中，選取條帶較亮樣品的DNA,用引物PCV-N1和PCV-N2進(jìn)行全序列的擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min；95℃變性50s，51℃退火40s，72℃延伸1 min 20s，36個(gè)循環(huán)；72℃延伸l0 min，4℃無(wú)限延伸。將PCR陽(yáng)性擴(kuò)增條帶進(jìn)行膠回收純化，采用北京諾維森生物科技有限公司生產(chǎn)的DNA回收試劑盒回收擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段。將回收產(chǎn)物與pMD-19-T載體16℃連接過(guò)夜，連接反應(yīng)體系：回收產(chǎn)物 4.5 μL，pMD-19-T載體 0.5 μL，SolutionⅠ連接酶5 μL，共10 μL。將連接產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)15 h后，挑取白色菌落接種于10 mL含Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，然后做菌落PCR鑒定。在含有Amp的LB固體平板上挑取單個(gè)白色菌落作為模板進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系與條件同前。取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察。

1.8 庫(kù)車縣PCV-2流行株基因分型 選取經(jīng)鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒的菌落，激活培養(yǎng)后送華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序，然后與國(guó)內(nèi)外流行株進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分析。

2 結(jié)果

2.1 血清中PCV-2抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果 在被檢的443份血清中，共檢出PCV-2抗體陽(yáng)性的血清367份，平均陽(yáng)性率為82.84%。從表1可知，不同生長(zhǎng)階段豬陽(yáng)性率不同，斷奶仔豬、育肥豬、母豬、公豬的PCV-2陽(yáng)性率分別是79.09%、83.5%、90.27%、83.3%。

表1 不同年齡階段豬血清樣品中PCV-2抗體檢測(cè)

2.2 不同區(qū)域豬PCV-2血清抗體檢測(cè)結(jié)果 不同區(qū)域豬場(chǎng)飼養(yǎng)管理、飼養(yǎng)環(huán)境不同，豬群血清PCV-2抗體平均陽(yáng)性率有較大差異。根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查情況及表2可以看出,飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)管理好的區(qū)域豬場(chǎng)陽(yáng)性率相應(yīng)較低。

2.3 PCV-2的基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果 將采取的18頭生豬組織無(wú)菌研磨，從中提取DNA，將其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，之后取擴(kuò)增產(chǎn)物20 μL進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果在第1、3、5、6、7、9、11、12、17、18孔分別出現(xiàn)了1條 982 bp左右的條帶（圖1、圖2），與預(yù)期片段大小一致。

2.4 PCV-2的測(cè)序結(jié)果分析 將鑒定正確的重組載體送華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)在基因庫(kù)里進(jìn)行比較此次分離鑒定的PCV-2與基因庫(kù)上已提交的PCV-2的其他菌株如 GD-sz、DF-1、NY0912、GXXJ1104、CZ1005存在著99%的同源性。

表2 不同區(qū)域豬血清樣品中PCV-2抗體檢測(cè)

3 討論

本試驗(yàn)血清樣品來(lái)自本縣多個(gè)豬場(chǎng)的不同日齡豬群，具有一定代表性。通過(guò)ELISA檢測(cè)了32個(gè)豬場(chǎng)的443份血清樣品，對(duì)不同養(yǎng)殖場(chǎng)、年齡豬的血清學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)進(jìn)行了綜合分析。從6個(gè)區(qū)域的血清樣品PCV-2抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，總抗體的陽(yáng)性率為82.84%，這與其他有關(guān)報(bào)道的抗體總陽(yáng)性率基本相符合[4]。ELISA結(jié)果顯示，庫(kù)車縣PCV-2抗體總平均陽(yáng)性率較高，應(yīng)該引起高度重視。

本次調(diào)查顯示，所有受檢豬場(chǎng)均存在不同程度PCV-2感染。對(duì)血清來(lái)源不同日齡段進(jìn)行分析，不同日齡段的豬群血清PCV-2抗體平均陽(yáng)性率有較大差異。母豬抗體陽(yáng)性率最高為90.27%，其次為公豬和育肥豬，抗體陽(yáng)性率分別是83.3%、83.5%，仔豬抗體陽(yáng)性率最低為79.09%，這與先前報(bào)道的PCV-2病毒感染隨豬的年齡增長(zhǎng)而升高結(jié)論是一致的[5]，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的同一豬群豬的年齡越大，PCV-2的抗體陽(yáng)性率就越高一致[6]。

經(jīng)過(guò)對(duì)庫(kù)車縣生豬的組織病料進(jìn)行PCV-2的病原學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)了18份病料，陽(yáng)性病料10份，陽(yáng)性率是55.6%。測(cè)序結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)與其他地方的PCV-2相比，PCV-2的流行和分布具有一定的地域性，在已確定庫(kù)車縣的生豬未經(jīng)免疫的時(shí)候已經(jīng)存在PCV-2病毒，為我縣以后的預(yù)防和控制此病提供了科學(xué)的數(shù)據(jù)。分析和確診我縣PCV-2毒株的基因組，對(duì)于研究其分子流行病學(xué)具有十分重要的意義。

PCV-2感染在我國(guó)豬群中已十分普遍，現(xiàn)己證實(shí)圓環(huán)病毒會(huì)導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征(PMWS)的主要病原豬是圓環(huán)病毒的天然宿主,病毒通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播,或在豬群中水平傳播，各種年齡段、不同性別的豬都可感染，公豬和母豬發(fā)病率高。由于PMWS是一種免疫抑制性疾病，往往會(huì)給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的威脅和損失。因此各養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)嚴(yán)格按生豬計(jì)劃免疫程序，提高其他疫病的免疫保護(hù)率，減少混合或繼發(fā)感染。重點(diǎn)加強(qiáng)豬瘟、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征的免疫，同時(shí)加強(qiáng)豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒病的免疫工作，提高豬的抵抗力，減少其他疾病與豬圓環(huán)病毒病的協(xié)同作用，從而降低生豬疫病的發(fā)生。

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