崔曉妮，陶 爽，劉祥新，田文儒，曹榮峰

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省日照市園林管理局，山東 日照 276800）

動(dòng)植物中廣泛分布的基質(zhì)金屬蛋白酶家族（matrix metalloproteinases,MMPs)是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）必不可少的酶，幾乎能降解ECM的所有成分[1]，其參與胚胎的發(fā)育及組織重塑，并在多種病理過程中發(fā)揮作用，如炎癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、腦血管病和多發(fā)性硬化等過程[2]。奶牛子宮內(nèi)膜炎是常見的產(chǎn)科病，該病給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究MMP-2、MMP-9與人慢性子宮內(nèi)膜炎和不孕癥之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，可以用MMP-2和MMP-9評(píng)估子宮內(nèi)膜的狀態(tài)。但奶牛子宮內(nèi)膜組織中MMPs能否對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜炎的診斷與治療提供參考，尚缺乏試驗(yàn)證實(shí)。為此，筆者通過采集患子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮內(nèi)膜組織樣本，檢測(cè)MMP-2、MMP-9的mRNA表達(dá)及酶活性，來闡明奶牛子宮內(nèi)膜炎與MMPs之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 選擇未配種的健康奶牛和患子宮內(nèi)膜炎奶牛，分別收集子宮。

1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶和DNA Marker，購(gòu)自（大連）TaKaRa公司；EASY spin組織/細(xì)胞RNA快速抽提試劑盒，購(gòu)自原平皓（天津）生物技術(shù)有限公司；BioRT cDNA第一鏈合成試劑盒，購(gòu)自杭州博日科技有限公司；明膠酶譜法和組織切片的常規(guī)試劑。

1.3 主要儀器 UVP：Bio-Rad；PCR儀：Bio-Rad；-80℃低溫冰箱（725型）：Sanyo；臺(tái)式離心機(jī)：Sigma；生物顯微鏡：OLYMPUS；組織切片機(jī)等。

1.4 奶牛子宮內(nèi)膜上皮組織切片的制作 根據(jù)組織切片的要求，分別取子宮內(nèi)膜制作常規(guī)的組織切片。切片進(jìn)行常規(guī)H.E.染色，染色完成后封片，并在顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.5 奶牛子宮內(nèi)膜組織總RNA的提取及cDNA的合成 剪取奶牛子宮內(nèi)膜分裝于凍存管中，-70℃保存。按EASY spin組織/細(xì)胞RNA快速抽提試劑盒的操作方法抽提細(xì)胞總RNA，按BioRT cDNA第一鏈合成試劑盒的操作方法獲得樣品cDNA。

1.6 奶牛MMP-2、MMP-9及GAPDH的引物合成如表1所示，MMP-2、MMP-9及內(nèi)參GAPDH的引物設(shè)計(jì)參考Birendra[3]，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.7 奶牛子宮內(nèi)膜組織MMP-2和MMP-9 mRNA的PCR檢測(cè)法 50 μL PCR反應(yīng)體系：10×RT Buffer 5.0 μL、dNTP Mixture 5.0 μL、上游引物2.0 μL、下游引物2.0 μL、MgCl2（25mmol/L）、模板2.0 μL、Fermentas Taq（5 U/μL）0.25 μL、滅菌蒸餾水27.95 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸1 min；30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，由凝膠成像分析系統(tǒng)拍照鑒定，用Glyko Band Scan 5.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量：mRNA相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶光密度值/對(duì)應(yīng)的GAPDH條帶光密度值。

1.8 明膠酶譜法檢測(cè)奶牛子宮內(nèi)膜組織中MMP-2、MMP-9的活性 制備含1%明膠的分離膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，上樣量為16 μL/孔，4℃、100 V電泳1.5 h。取出凝膠洗脫40 min×2次，漂洗20 min×2次，置37℃孵育液中42 h，染色液3 h，分別置脫色液A、B、C中脫色0.5、1、2 h，用Glyko Band Scan 5.0分析讀取灰度值，做統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，采用ANOVA法進(jìn)行組間差異性的比較。

2 結(jié)果

2.1 患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化 肉眼觀察患子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮發(fā)現(xiàn)，子宮肥大，剖檢可見子宮壁肥厚，子宮內(nèi)膜出血和水腫，子宮腔內(nèi)有大量渾濁、黏稠、黃白色的膿性分泌物。

圖1 對(duì)照組奶牛子宮內(nèi)膜上皮組織 （H.E.400×）

圖2 子宮內(nèi)膜炎患牛子宮內(nèi)膜上皮組織 （H.E.400×）

分別對(duì)患病組和對(duì)照組奶牛子宮進(jìn)行組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞排列整齊，黏膜下層細(xì)胞疏松且有規(guī)律。患病組奶牛子宮內(nèi)膜上皮有破損和脫落現(xiàn)象，上皮層有零散的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜下層炎性細(xì)胞明顯浸潤(rùn)，有淤血現(xiàn)象。

2.2 奶牛子宮內(nèi)膜組織中MMP-2、MMP-9和GAPDH基因的PCR鑒定 分別對(duì)患病組和對(duì)照組奶牛子宮內(nèi)膜組織中的MMP-2、MMP-9和GAPDH基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果如圖3。從圖3可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和患病組分別在預(yù)期位置出現(xiàn)了條帶，其分子量與預(yù)期大小一致。用Glyko BandScan軟件掃描各組基因條帶灰度，計(jì)算內(nèi)參比并取平均值作為mRNA的相對(duì)表達(dá)量，其結(jié)果見表2。從表2可以看出，患病組織中MMPs的mRNA含量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

表2 奶牛子宮內(nèi)膜MMP-2、MMP-9mRNA的變化

2.3 奶牛子宮內(nèi)膜組織中MMP-2、MMP-9的酶活性鑒定 用明膠酶譜法分別檢測(cè)患病組和對(duì)照組奶牛子宮內(nèi)膜組織中MMP-2和MMP-9的酶活性，結(jié)果看出分別在72 kD和92 kD處出現(xiàn)了條帶，分別是MMP-2和MMP-9的預(yù)期位置。掃描各組蛋白條帶的灰度值，取平均值，結(jié)果見表3。從表3可以發(fā)現(xiàn)，患病組MMP-2和MMP-9的酶活性顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

3 討論

試驗(yàn)證實(shí)，MMPs可直接參與免疫應(yīng)答，在炎癥反應(yīng)過程中既能抵御也能促發(fā)炎癥。研究顯示，在自身免疫性腦炎、缺氧性腦損傷和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中，MMP-2和MMP-9通過分解閉鎖蛋白來調(diào)節(jié)內(nèi)皮的通透性和炎癥發(fā)生[4-5]。

表3 奶牛健康/患病子宮內(nèi)膜組織中MMP-2、MMP-9的酶活性

子宮內(nèi)膜的MMPs能參與子宮內(nèi)膜的重建、囊胚的種植及滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤(rùn)[6]。Keiichiro等[7]曾經(jīng)報(bào)道，奶牛妊娠期子宮內(nèi)膜及胎盤均表達(dá)MMP-2和MMP-9，MMP-2 mRNA表達(dá)隨妊娠先下降再增強(qiáng)；而MMP-9 mRNA表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，認(rèn)為MMPs參與了子宮內(nèi)膜的改造。而Soboleva等[8]認(rèn)為，檢測(cè)血清中MMP-2可以監(jiān)控慢性子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生及治療效果。據(jù)此，我們推測(cè)這兩種MMP在子宮復(fù)舊、子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生發(fā)展過程中也應(yīng)起著重要的作用。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，所采集的患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮組織中MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，且其酶活性也顯著高于對(duì)照組，驗(yàn)證了上述推測(cè)。本試驗(yàn)結(jié)果也說明奶?；甲訉m內(nèi)膜炎時(shí)，奶牛通過調(diào)控子宮內(nèi)膜組織中明膠酶的含量，來降解子宮內(nèi)膜組織中的EMC，松弛子宮壁從而促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，起到促進(jìn)奶牛子宮局部炎癥發(fā)生發(fā)展的作用。

[1]陳華江，王杰軍.基質(zhì)金屬蛋白酶的結(jié)構(gòu)及其調(diào)節(jié)機(jī)制[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè)，2001，28(1):20-23.

[2]高穎，蔡定芳.基質(zhì)金屬蛋白酶-9與炎癥反應(yīng)研究進(jìn)展[J].中國(guó)病理生理雜志，2003，19(8):1133-1136.

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