李長龍，陳建飛，張 鑫，時洪艷，馮 力

（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室豬傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001）

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的以仔豬腹瀉、嘔吐和脫水為主要癥狀的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。PED在世界范圍內廣泛流行，1978年首次在英國和比利時暴發(fā)[1-2]。我國PED流行也非常嚴重，自2010年下半年開始同豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等混合感染呈現(xiàn)大規(guī)模流行?，F(xiàn)地病料檢測結果表明，2010-2011年我國部分地區(qū)PEDV的感染率高達54.7%，遠高于豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）(38.1%)和豬輪狀病毒（PoRV）（5.04%）的感染率[3]，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

PEDV其基因組從5′～3′依次編碼復制酶多聚蛋白1ab、纖突蛋白（S）、ORF3蛋白、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。其中ORF3基因是PEDV基因組中的惟一輔助基因，也是造成強弱毒差異的主要基因[4-5]，疫苗毒在ORF3內部存在堿基缺失現(xiàn)象。

目前國內外PEDV商品化疫苗毒株均為基因缺失弱毒疫苗，如我國的CV777株，日本的P-5V株和韓國的KPED-9和DR13株等[6]。這3個疫苗毒株均是從患病仔豬分離到強毒后經(jīng)Vero細胞連續(xù)傳代致弱而成。通過分析ORF3基因，在其缺失區(qū)域兩端設計合理的引物，采用RT-PCR方法可對野毒和疫苗毒感染進行鑒定（引物所在位置見圖1）。我們對黑龍江、吉林等地區(qū)送檢的15份病料進行了檢測，發(fā)現(xiàn)PEDV呈現(xiàn)混合感染，但仍以野毒感染為主，從而為PEDV的診斷和免疫提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 來自黑龍江、吉林等地有腹瀉、嘔吐等癥狀仔豬的小腸和糞便，共15份。

1.2 陽性質粒 PEDV野毒株（CH/S株）和疫苗株的ORF3基因陽性質粒均由本實驗室克隆、保存；在本試驗中做為陽性對照模板。

1.3 主要試劑 TRIZol總RNA提取試劑，購自Invitrogen公司；鼠源反轉錄酶（M-MLV）及反轉錄試劑，購自Promega公司；EmeraldAmp PCR Master Mix，購自TaKaRa公司。

1.4 引物設計 根據(jù)PEDV野毒/疫苗毒ORF3基因序列比對后結果在疫苗毒缺失區(qū)域兩端用Primer 5.0設計引物，引物序列：PORF3-U：5′-GGAGCTCAATGTAGTTCCAA-3′(24 881～24 900)；PORF3-L：5′-AGCTGCTTTACCATTGAGAA-3′(25 180～25 199)，由哈爾濱博仕生物技術有限公司合成。預期野毒擴增長度為319 bp，疫苗毒擴增長度為270 bp。

1.5 特異性檢驗 以PEDV野毒株CH/S和疫苗株ORF3陽性質粒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖和呼吸綜合征病毒的cDNA為模板進行PCR擴增。反應在20 μL體系中進行，預混酶10 μL；cDNA 1 μL；上下游引物各1 μL；水7 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.6 病料處理和總RNA提取 取適量小腸內容物或糞便放入1.5 mL滅菌EP管中，加入800 μL PBS混懸后12 000 r/min，（4 ℃）離心10 min，取上清，按照TRIZol說明書提取總RNA。

1.7 cDNA合成和PCR檢測 按照鼠源反轉錄酶（M-MLV）及反轉錄試劑說明書合成，以合成的cDNA模板進行PCR擴增。反應體系和反應條件同1.5。擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果

2.1 PEDV野毒株和疫苗株ORF3基因的擴增 以PEDV 野毒 CH/S（GU372733）和 PEDV 疫 苗 毒 株CV777細胞適應毒（GU372744）ORF3基因的陽性質粒為模板進行PCR擴增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，野毒擴增片段為319 bp，疫苗毒擴增片段為270 bp，與預期大小相符，差異明顯（圖2）。

2.2 特異性擴增 以已檢測確診的TGEV、PoRV、PRRSV、PRV、SFV陽性病料的cDNA為模板進行擴增。2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示沒有目的條帶，而PEDV野毒和疫苗毒均有預期大小的目的條帶，表明本研究所設計的鑒別引物擴增效果特異性較好（圖3）。

2.3 病料cDNA擴增 對2012年10月份至2013年2月份送檢的15份疑似PEDV感染豬病料cDNA為模板進行擴增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，15份病料均能檢測到PEDV，其中13份為野毒感染，2份為疫苗毒感染(圖4)。

3 討論

PEDV是引起仔豬腹瀉的重要病原之一，而且新生仔豬一旦發(fā)病，死亡率往往接近100%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失，自2010年下半年以來，我國出現(xiàn)大范圍的豬流行性腹瀉疫情，而且疫情多持續(xù)存在。經(jīng)本實驗室所檢測病料數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結果顯示，PEDV感染率明顯高于另外兩個豬病毒性腹瀉病原-TGEV和PoRV[7]。

圖4 病料cDNA擴增

PEDV的ORF3基因是PEDV毒力的決定性因素之一[8]。弱毒普遍都是在ORF3基因中連續(xù)缺失數(shù)十個堿基，而且在弱毒缺失區(qū)域周圍的序列卻相對保守，不同毒株的ORF3基因相似性達到97.8%[8-9]。這也為PEDV野毒和疫苗毒的鑒定提供了一個很好的基礎。

目前已有多個實驗室建立了多種PEDV病毒檢測方法[10-11]。但是目前這些對PEDV病原的檢測也多無法區(qū)別野毒和疫苗毒。本研究利用PEDV強弱毒株之間自然存在的ORF3基因部分缺失設計引物進行檢測，既可以對PEDV病原進行檢測，還可以通過PCR產(chǎn)物大小進行野毒疫苗毒鑒別診斷，而且費用相對較低，可進行大規(guī)模流行病學調查。對PEDV的免疫和強毒感染情況進行區(qū)分，有助于減少免疫豬被淘汰的可能，降低經(jīng)濟損失。

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