黃迪海，劉 霞，盛曉丹，董玉蘭，綦學慧，張從敬，徐秀榮，張再輝，秦卓明，3?

（1.山東省健牧生物藥業(yè)有限公司，濟南250100；2.濟南市動物生物藥品工程技術研究中心，濟南250100；3.山東省農業(yè)科學院家禽研究所，濟南250023；4.中國農業(yè)大學，北京100094）

獸用雞脾轉移因子（Transfer Factor，TF）是具有免疫活性的T淋巴細胞在抗原或絲裂原的刺激下釋放的一類可透析的小分子多肽，具有增強淋巴細胞轉化，提高機體免疫功能的作用。TF可將供體的細胞免疫功能特異地轉給受體，而且能轉移包括真菌、細菌、病毒、寄生蟲、組織相容性抗原和腫瘤抗原等多種抗原的細胞免疫，是一種新型免疫制劑［1］。

自20世紀50年代首次發(fā)現TF至今，國內外研究人員對其進行了廣泛深入的研究和應用，發(fā)現TF具有分子質量小、無毒、無抗原性、不引起過敏反應、不產生特異性抗體，且可超越種屬界限應用等優(yōu)點，具有治療免疫缺陷［2］、惡性腫瘤［3］、感染性疾?。?］等作用。1979年以后，國內外逐漸將TF應用于獸醫(yī)免疫和臨床治療。2011年，我國批準獸用轉移因子口服溶液上市。TF在防治動物傳染病［5］、增強機體免疫［6］、提高疫苗效果［7］等方面效果確切，但其多肽組成不明確，在調控腸道粘膜屏障中的作用機理不清楚，嚴重制約TF的應用。本研究旨在探索雞脾轉移因子的多肽組成，為進一步研究其有效成分和作用機理提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料 獸用雞脾轉移因子，由山東省健牧生物藥業(yè)有限公司生產，多肽含量≥1mg／mL，樣品生產批號為：20121101、20121102、20121103；綿羊靜脈血；新鮮豬胸腺；乙腈、超純水，色譜純；TrisHCL、NaCl、KH2PO4等試劑均為分析純。

1.2 儀器 高速組織搗碎機，質譜儀（LTQVelos），分光光度儀（P-2000），醫(yī)用低速離心機，恒溫水浴鍋，顯微鏡（XSS-2A）。

1.3 方法

1.3.1 多肽含量測定 按照福林酚Lowry法［8］測定獸用雞脾轉移因子樣品溶液的多肽含量。

1.3.2 分子量測定 采用MALDI-TOF-MS法，檢測條件為固體激光源波長355 nm，離子類型為正離子，檢測方式為反射方式（飛行管長2.7 m，加速電壓20 kV，反射電壓23 kV）和線性方式（飛行管長1.22 m，加速電壓kV），基質為CHCA和SA。試驗樣品溶液ziptip脫鹽后MALDI-TOF-MS分析，根據分子量圖譜確定樣品分子量。

1.3.3 多肽組成分析

1.3.3.1 樣品處理 樣品用10 kD超濾管離心超濾，通過10 kD超濾管的小肽不用酶解，直接用質譜分析，選擇no enzyme。未通過10 kD超濾管的樣品，將超濾管反轉后離心，取樣品約 30 μg，加入 30 μL STD buffer，沸水浴 5 min，冷卻至室溫；加入 200 μL UA buffer（8 mol／L Urea，150 mmol／L TrisHCl pH8.5）混勻，轉入30 kD超濾離心管，離心；加入200μL UA buffer離心，棄濾液。 加入100 μL IAA（50 mmol／L IAA in UA），振蕩1 min，避光室溫 30 min，離心；加入100 uL UA buffer，離心，重復 2 次；加入 100 μL 25 mol／LNH4HCO3，離心，重復 2 次；加入 40 μL Trypsin buffer （2 μg Trypsin in 40 μL25 mol／L NH4HCO3），振蕩1 min ，37 ℃ 16～18 h。 換新收集管，離心，收集濾液，進行質譜分析，選擇Trypsin。

1.3.3.2 毛細管高效液相色譜方法 A液為0.1%甲酸的水溶液，B液為0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈為84%）。色譜柱以95%的A液平衡后，樣品由自動進樣器上樣到Trap柱。0～105 min，B液線性梯度從4% 到50%；105～114 min，B液線性梯度從50%到100%；114～120 min，B液維持在100%。

1.3.3.3 質譜數據采集 多肽和多肽碎片的質量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個碎片圖譜（MS2 scan）。

1.3.3.4 數據分析 原始文件用BIOWORKS軟件搜索相應的數據庫。查詢IPI數據庫CHICK（v3.81）分類系統(tǒng)，得到鑒定的蛋白質結果。

1.3.4 活力測定 按照國家衛(wèi)生部新藥轉正標準西藥第四十七冊中脫E受體法［8］，制備脫E受體胸腺T細胞懸液，使最終濃度為每1 mL含3×106～5×106個細胞；制備綿羊紅血球懸液，使最終濃度為脫E受體胸腺T細胞懸液濃度的8～10倍；取供試品，用 Hank’s液配制成每1 mL中含1 mg的供試品溶液；取小試管6支，其中3支各加Hank’s液0.1 mL作為對照管，另3支各加供試品溶液0.1 mL作測定管，每管中各加脫E受體胸腺T細胞懸液0.2 mL，37℃保溫1 h，加綿羊紅血球懸液 0.2 mL，混勻，500 r／min 離心 3 min，4 ℃冰箱過夜；次日取出，棄上清液，每管中各加固定液1滴，輕輕搖勻，靜置10 min，加染色液2滴并搖勻，靜置15 min后開始計數。顯微鏡視野中淡藍色的較大的細胞為淋巴細胞，共數計數板16個大方格上所有淋巴細胞的個數（不少于200個），統(tǒng)計其中的E玫瑰花結形成的細胞數（結合3個以上綿羊紅細胞的淋巴細胞），計算結花百分率，取平均值，即為供試品管或對照管的平均數。樣品活力＝供試品測定管E玫瑰花結百分率-對照管E玫瑰花結百分率。

2 結果與分析

2.1 多肽含量 用紫外-可見分光光度法，在650 nm波長處測定不同濃度牛血清白蛋白標準品溶液的吸光度，獲得標準曲線（見圖1），標準方程為：y ＝ 0.0125x+0.0038（R2＝ 0.9986） 。 樣品10×6 倍稀釋液吸光度檢測值分別為0.330、0.332、0.331，帶入標準方程，計算，多肽濃度分別為 26.10 μg／mL、26.26 μg／mL、26.18 μg／mL，平均值為 26.18 μg／mL，樣品原液多肽含量平均值為1570.8 μg／mL，符合獸用轉移因子口服溶液國家標準多肽含量≥1 mg／mL的規(guī)定。

圖1 標準曲線圖

2.2 分子量 反射模式檢測多肽分子量范圍為800～8000 Da，獲得多種小肽，小肽分子量為800.2175～7475.9980 Da，主要集中于800～4000 Da（圖2）；線性模式檢測分子量范圍為4000～20000 Da，獲得分子量為6017.6611 Da和8279.9307 Da的兩個多肽（圖3）。

圖2 G1_800_8000_反射模式的分子量圖譜

圖3 G1_4000_20000_線性模式的分子量圖譜

2.3 多肽組成 檢測獲得多肽共計581種，包括：非酶切方式獲得的多肽共512種，主要有T細胞凋亡抑制相關蛋白（TIAL1）、胸腺肽 β4（TMSB4X）、殺菌／通透性增加蛋白（BPIL3）、酶、肌動蛋白、血紅蛋白等，具有代表性的多肽（表1）；酶切方式獲得的多肽共 69種，主要有抑制因子活化蛋白（RAP1Ab）、抗菌肽（Cathelicidin-2）、細胞色素C（Cytochrome c）等，代表性蛋白見表2。

2.4 活力測定 采用脫E受體法測得，對照管16方格所有淋巴細胞268個，E玫瑰花結細胞31個，結花百分率為11.57%，樣品管16方格所有淋巴細胞289個，E玫瑰花結細胞65個，結花百分率為22.49%，樣品活力為10.92%（圖4）。

表1 非酶切方式獲得的具有代表性的多肽

表2 酶切方式獲得的具有代表性的多肽

圖4 顯微鏡下E玫瑰花結（A為對照品，B為樣品）

3 討論

3.1 轉移因子的多肽組成 轉移因子作為一種免疫調節(jié)劑廣泛應用于人醫(yī)和獸醫(yī)領域。國家標準［編號：WS1-（X-451）-2003Z］中規(guī)定了其主要成分是多肽和核苷酸。國內眾多研究人員對轉移因子的氨基酸組成、多肽含量、多肽與核苷酸比例、活性成分混合物等進行了研究。何理平［9］報道，轉移因子多肽與小分子RNA的比例為2∶1。范振青等［10］對豬脾轉移因子水解后檢測，證實其含16種氨基酸，其中以天冬氨酸，谷氨酸和甘氨酸含量較高。劉剛等［11］對轉移因子進行氨基酸分析，測得組成多肽的氨基酸占總氨基酸的1／3，游離氨基酸占2／3。凌紅麗［12］采用凝膠色譜層析法分離轉移因子得到三個洗脫峰并進行活性測定，表明轉移因子主要包含三大組分。本試驗在驗證雞脾轉移因子多肽含量的基礎上，利用LC-MS法檢測其多肽組成，揭示了雞脾轉移因子含有T細胞凋亡抑制相關蛋白（TIAL1）等581種多肽，并通過查詢數據庫，獲得了對應的蛋白序列，初步闡明了雞脾轉移因子的多肽組成，為國內首次報道。

3.2 轉移因子分子量及其分布 轉移因子的分子量一般在3000～15000 Da。本試驗利用質譜法分析測定雞脾轉移因子分子量分布范圍為800 Da～8280 Da，主要為分布于4000 Da以下。雖然利用上述方法測定的分子量都在10000 Da以下，但是在多肽組成測定試驗中，仍然分析到了69種分子量大于10000 Da的多肽，具體原因有待進一步研究。

3.3 轉移因子功能與組分的關系 轉移因子具有增強細胞免疫［13-14］和體液免疫［15］，增強非特異性免疫［16］、抗免疫抑制［17］等作用，但具體是何種成分發(fā)揮作用暫無報道。本試驗在檢測確定雞脾轉移因子生物活性的基礎上，對其所含多肽進行分析，證實了轉移因子含有與細胞結構和運動相關的肌動蛋白，含有與免疫相關的T細胞凋亡抑制相關蛋白、胸腺肽、抑制因子活化蛋白等，含有與生長發(fā)育相關的轉錄因子蛋白，含有與抗應激相關的熱休克蛋白，含有與疫病相關的殺菌／通透性增加蛋白、抑癌蛋白、抗菌肽等。上述蛋白均具有一定的生物學活性，可能與轉移因子的功能密切相關。下一步需要通過基因合成和體外表達等方式獲得相關多肽蛋白，進一步研究其生物活性，進而驗證雞脾轉移因子的有效成分和作用機理。

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