張 輝，崔煥忠，楊 歡，馬思慧，吳天成，蘭海楠，鄭 鑫

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春130118）

分泌型 IgA（Secretory immunoglobulin A，SIgA）作為粘膜免疫的主要效應(yīng)因子，在啟動免疫學(xué)生物活性，清除病原，保護機體抗感染等方面發(fā)揮重要作用［1］。SIgA含量高低與機體的粘膜免疫狀況以及癌癥等疾病密切相關(guān)［2-3］，檢測SIgA含量不僅可以監(jiān)測機體粘膜免疫狀態(tài)，還可有助于疾病診斷。分泌片（secretory component，SC）是構(gòu)成SIgA分子的組成部分［4］，可以通過檢測SC來測定SIgA的含量。SC在初乳中以游離和結(jié)合兩種存在形式存在［5］，本研究以初乳為材料，分離純化游離SC，并制備了抗SC的多克隆抗體，為檢測SIgA免疫學(xué)檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 Sephadex G-200凝膠（上海化學(xué)試劑廠）；DEAE纖維素（DE52）及透析袋（Whatman公司）；Anti SC McAb（美國 Sigma公司）；蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）；低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（寶生物大連有限公司）；豬初乳采自長春市某豬場；雄性健康新西蘭大耳白兔（長春市生物制品所）。

1.2 試驗方法

1.2.1 初乳中SIgA及分泌片的初步提取 參照胡正強等方法［6］，取 100 mL 豬初乳，4 ℃ 5000 r／min 離心30 min，吸取脂肪層與沉淀之間的液體約80 mL，加入疊氮鈉至終濃度為0.1%，用1 mol／L HCl調(diào)pH至4.0，4500 r／min 離心30 min，棄去沉淀，收集上清液，用 2 mol／L Tris 調(diào) pH 至7.3，4500 r／min 離心30 min，將上清液過0.45 μm濾器，獲得初乳提取物。

1.2.2 SephadexG-200分子篩凝膠層析法分離初乳提取物 稱取適量的SephadexG-200，用生理鹽水充分膨脹，煮沸，按常規(guī)方法裝柱，用生理鹽水平衡至上樣。將初乳提取物用生理鹽水透析過夜后，加于柱上，利用自動分步收集器收集洗脫液，每管5 mL，用分光光度計測定洗脫液OD280nm值，根據(jù)OD280nm值繪制曲線，分別收集不同洗脫峰，第一峰液體主要為IgG和SIgA的混合物，第二峰液體含有SC［7］。

1.2.3 DEAE 52離子交換層析分離第一峰洗脫液將收集的第一峰洗脫液混合在一起，用50%PEG6000濃縮后，用 0.01 mol／L的 PB 液（pH7.4）4℃平衡過夜，中間更換透析液數(shù)次，蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將DEAE 52以堿-酸-堿處理活化后，按照常規(guī)方法裝柱，用0.01 mol／L的PB液（pH7.4）平衡柱子，至流出液體的pH值與流入液體的pH值相等時，開始上樣，待樣品進入交換劑中，用少量緩沖液沖洗柱壁，然后用0.01 mol／L的PB液（pH7.4）進行洗脫，利用自動分步收集器收集洗脫液，每管5 mL，洗脫蛋白峰為IgG，至無蛋白洗脫下來時，改用0.1 mol／L的PB液（pH6.8）進行洗脫，收集洗脫液，即為純化的 SIgA［8］。

1.2.4 硫酸銨鹽析法分離純化第二峰洗脫液中的SC將收集的第二峰洗脫液合并到一起，緩慢加入飽和硫酸銨溶液至終濃度為33%，室溫下靜置1 h，3000 r／min離心 20 min，棄去沉淀（為 IgG），將上清液裝入透析袋，用蒸餾水4℃透析，期間更換蒸餾水?dāng)?shù)次［9-10］。再用PEG6000濃縮，測定其蛋白濃度。

1.2.5 SDS-PAGE分析純化蛋白的分子量及純度配制12%的分離膠，將樣品與等量的2倍上樣緩沖液混勻，煮沸5 min，加樣。積層膠電壓為80 V，當(dāng)電泳至濃縮膠和分離膠界面，再升壓至120 V，當(dāng)溴酚藍距凝膠邊緣1 cm處停止電泳，用考馬斯亮藍G250進行染色，觀察純化的SIgA及SC的分子量，利用凝膠薄層掃描分析蛋白純度。

1.2.6 瓊脂雙向免疫擴散鑒定純化蛋白 稱取一定量的瓊脂粉，以1%的比例加入生理鹽水，充分融化后倒入平皿中，冷卻后打孔，取10 μL Anti SC McAb加入中央孔，外周分別加入分離純化的SIgA和SC液體［11］，放入濕盒中，置于37℃培養(yǎng)箱中，24 h后觀察結(jié)果。

1.2.7 抗SC多克隆抗體的制備 取1 mg純化的SC，與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后，背部脊柱兩側(cè)、皮下分5點接種兔子，共接種3只；二免，兩周后取1.5 mg純化的SC與等體積弗氏不完全佐劑乳化，以相同的免疫方式接種兔子；三免，間隔兩周后取2 mg純化的SC蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化后，以同樣免疫方式接種兔子；加強免疫，三免二周后耳靜脈注射不加佐劑純化的SC蛋白進行加強免疫。加強免疫7 d后，耳靜脈采血1 mL，37 ℃靜置1 h，4 ℃靜置2 h 后，3500 r／min 離心10 min，吸取血清，以分離純化的SIgA為檢測抗原，采用瓊脂雙向免疫擴散檢測血清抗體效價，達到要求后，心臟采血，收集血清，分裝后于-20℃冷凍保存。

2 結(jié)果

2.1 初乳提取物進行SephadexG-200凝膠層析將初乳提取物過SephadexG-200篩凝膠層析，根據(jù)洗脫液OD280nm值繪制曲線，第一峰（收集洗脫液第11～36管）為SIgA（含IgG）和第二峰（收集洗脫液第39～44管）為 SC（圖1）。

2.2 第一峰液體過DEAE 52離子交換層析柱將第一峰液體濃縮后，測定其蛋白濃度為0.82 mg／mL，取20 mL蛋白液過DEAE 52離子交換層析柱。用0.01 mol／L的 PB液（pH7.4）洗脫后，再用0.1 mol／L的PB液（pH6.8）洗脫。根據(jù)洗脫液OD280nm值繪制曲線（圖2），第一峰（收集洗脫液第1～40管）為 IgG，第二峰（收集洗脫液第41～65管）為 SIgA。

圖2 第一峰液體過DEAE 52柱曲線

2.3 SDS-PAGE分析純化蛋白的分子量及純度 分離純化蛋白進行SDS-PAGE，結(jié)果表明純化的SIgA呈現(xiàn)SC、重鏈和輕鏈三條帶，SC的大小約為70 ku，重鏈位于66.4和44.3 ku之間約為50 ku，輕鏈位于29.0 ku和20.1 ku之間約為25 ku。分離的SC的分子量約為70 ku（圖3），與報道的大小相近。凝膠薄層掃描分析SIgA和分泌片純度分別為90%和89%。

圖3 提取SIgA和SC的SDS-PAGE結(jié)果

2.4 純化蛋白的鑒定 利用瓊脂雙向免疫擴散鑒定分離純化蛋白，結(jié)果表明純化的SIgA和SC分別與Anti SC McAb發(fā)生了特異性反應(yīng)（圖4）。

圖4 純化蛋白的鑒定結(jié)果

2.5 抗SC多克隆抗體的制備 以純化的SC為免疫抗原，以純化的SIgA為檢測抗原，制備抗SC多抗隆抗體，瓊脂雙向免疫擴散測定血清抗體的效價為1 ∶32。

3 討論

豬初乳來源相對廣泛，富含大量的SIgA和SC，且含雜蛋白較少［12］，有利于蛋白的分離純化。本實驗選取豬初乳作為SC的提取材料。在豬初乳粗提過程中參照了胡正強等分離純化方法，首先去除乳中的酪蛋白及脂肪等雜質(zhì)［13-14］，然后根據(jù)分離蛋白分子量不同，進行分子篩凝膠層析，將免疫球蛋白與SC分離開，最后根據(jù)免疫球蛋白的等電點不同，采用離子交換層析進行分離［15］，提取的SIgA純度較高，為90%，表明該種方法用于純化SIgA的效果較好，本研究獲得的SIgA可用于多抗制備的檢測抗原。

通過凝膠層析分離的SC洗脫液中含有少量的IgG，采用33%硫酸銨鹽析后，可以將IgG去除，獲得SC的純度為89%，高純度免疫抗原的獲得對于制備特異性多抗非常重要。陳斌利用制備了抗SC單克隆抗體［16］，單抗制備成本較高，操作繁瑣，而多抗制備相對省事省力。

SIgA與血清IgA在免疫學(xué)功能上有著顯著區(qū)別［17］，如何建立有效的方法將SIgA和IgA鑒別開，是準(zhǔn)確檢測SIgA的關(guān)鍵。血清IgA與SIgA的結(jié)構(gòu)差別在于血清 IgA沒有 SC結(jié)構(gòu)［18］，由于 SC是SIgA的特異成分，因而可以應(yīng)用抗SC特異性抗體檢測SIgA。本研究以分離純化的SC為免疫抗原，制備了效價較高的抗SC的多克隆抗體，以期建立特異的檢測粘膜組織中SIgA免疫組織化學(xué)方法，為下一步開展粘膜免疫激活劑對粘膜組織中SIgA分泌的影響奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

［1］付金龍，劉 沛.SC結(jié)構(gòu)、功能及其臨床研究進展［J］.世界華人消化雜志，2009，（3）：293-298.

［2］孫 立，馬健飛，馮江敏，等.尿液SIgA含量測定在非感染性腎臟疾病中的意義［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，（2）：146-148.

［3］張寶中.分泌型免疫球蛋白A的研究進展［J］.生物技術(shù)通訊，2009，20（2）：263-265.

［4］曾常茜.分泌型IgA在黏膜抗感染中的作用［J］.北華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，6（1）：33-35.

［5］唐慶娟，戚 欣，耿美玉.多聚免疫球蛋白受體（pIgR）在粘膜免疫中的重要功能［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2007， 23（9）： 724-729.

［6］胡正強，黎 光，江詠梅，等.SIgA分泌片分離、純化研究［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進展，2002，30，（2）：35-38.

［7］吳勝昔，姜 平，李玉峰.抗豬SIgA單克隆抗體的研制［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2005，25（4）：390-393.

［8］劉曉飛，高學(xué)軍，姚永豪，等.牛初乳SIgA分離純化及其檢測方法的研究進展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2008， 39（10）： 131-135.

［9］楊 倩，毛衛(wèi)華.雞和豬分泌型免疫球蛋白A結(jié)構(gòu)蛋白的比較［J］.畜牧與獸醫(yī)， 2003， 35（10）： 5-7.

［10］梁靖坤，王繼芳，曹榮峰.奶牛初乳SIgA的提純與電泳分析［J］.中國農(nóng)學(xué)通報， 2009， 25（15）： 6-8.

［11］韓建保，王開功，于洪洋.雞SIgA的提取鑒定及其抗體制備［J］.貴州畜牧獸醫(yī)， 2008， 32（3）：5-7.

［12］周盛華，趙紅宇，朱洪艷，等.牛初乳中SIgA的分離純化［J］.中國乳品工業(yè)， 2011， 39（6）：12-13.

［13］周華波，房慧伶，李紅蕾，等.雞SIgA的純化及兔抗雞SIgA抗體的制備［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)， 2006， 10（12）： 24-26.

［14］姚永豪，高學(xué)軍，劉曉飛，等.牛初乳sIgA的分離純化［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2007，25（7）：43-44.

［15］馮志新，王海燕，劉茂軍，等.豬初乳中SIgA純化及其單抗制備［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2011， 27（5）： 1026-1030.

［16］陳 斌.SIgA分泌片的原核表達及抗分泌片單克隆抗體的制備［D］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［17］崔 巍，孫翠明，劉 沛.谷氨酰胺對腸粘膜上皮細胞合成多聚免疫球蛋白受體的影響［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2011，40（11）： 1452-1454.

［18］劉茂柯.豬SIgA直接ELISA檢測方法的建立及對豬肺炎支原體滅活疫苗免疫效果的評估［D］.四川：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.