刁有江，范學(xué)政

（1.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，濟(jì)南250100；2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

禽大腸桿菌病是由某些致病性大腸桿菌引起的家禽多種傳染性疾病的總稱［1-3］。該病是山東省規(guī)模化養(yǎng)禽場的常見病，發(fā)病率高，死亡率高，常與慢性呼吸道病、H9亞型禽流感等呼吸道疾病混合感染，給養(yǎng)禽業(yè)造成極大損失。為了有效開展禽大腸桿菌病的預(yù)防和治療工作，本研究對采自山東濰坊、煙臺、臨沂等8地市的家禽病料進(jìn)行了禽源致病性大腸桿菌的分離、血清型流行病學(xué)調(diào)查，并對分離到的大腸桿菌進(jìn)行了耐藥性檢測和分析，以期為疫苗的研制和臨床用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料 在2012年1～12月間，從山東省濰坊、臨沂、青島、煙臺、德州、濱州、聊城、濟(jì)寧8個地區(qū)的45家養(yǎng)禽場收集到128只初診為大腸桿菌病的病死雞。無菌采集病死雞的肝臟、脾臟、心血等病料，用于病原菌的分離。

1.2 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗O血清 20種大腸桿菌單因子抗O血清由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.3 試驗動物 10日齡健康海蘭白雛公雞購自濟(jì)南百事得牧業(yè)有限公司養(yǎng)雞場。

1.4 質(zhì)控菌株 大腸桿菌 ATCC25922、ATCC35218由吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)藥理實驗室惠贈。

1.5 培養(yǎng)基和試劑 麥康凱培養(yǎng)基為北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司產(chǎn)品；MH肉湯、LB肉湯為杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；普通營養(yǎng)瓊脂及葡萄糖、甘露醇、麥芽糖等10種生化培養(yǎng)基等為上海市醫(yī)學(xué)化驗所試劑廠產(chǎn)品。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉等試劑為天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.6 抗菌藥物 氟苯尼考、硫酸粘菌素、痢菌凈、土霉素、磺胺甲基異噁唑、甲氧芐啶為濟(jì)南美事達(dá)獸藥有限公司惠贈，其他藥品均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.7 病原菌的分離培養(yǎng) 無菌采集病死雞的肝臟、脾臟、心血等病料，劃線于麥康凱斜面，37℃培養(yǎng)18 h，挑取典型菌落在麥康凱平板上分區(qū)劃線，37℃培養(yǎng)18 h，選取單個典型菌落純培養(yǎng)后4℃冰箱暫存?zhèn)溆谩Ｈ∨囵B(yǎng)物，按常規(guī)方法進(jìn)行涂片、革蘭氏染色，對菌體形態(tài)、染色特性及莢膜進(jìn)行鏡檢。

1.8 生化特性 按常規(guī)方法［4］，對分離到的大腸桿菌進(jìn)行三糖鐵試驗、吲哚試驗等生化測定。

1.9 血清型鑒定 取被檢細(xì)菌純培養(yǎng)物用生理鹽水離心、洗滌2次，稀釋成100×108／mL的菌懸液，用水煮沸2.5 h，破壞其莢膜抗原。應(yīng)用微量凝集試驗，用大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗“O”血清，對所分離的菌株進(jìn)行血清型的鑒定［5］。定型標(biāo)準(zhǔn)為血清的試管凝集價不小于 1 ∶640［3］。

1.10 致病性試驗 挑取普通瓊脂斜面上純培養(yǎng)的菌落，接種于LB肉湯培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)24 h作為接種液。每株大腸桿菌培養(yǎng)物各隨機(jī)腹腔注射5只10日齡健康雛公雞0.2 mL（每mL含約108CFU），作為一個試驗組。另取5只雛公雞腹腔注射0.2 mL肉湯作為對照。在96 h內(nèi)觀察其發(fā)病與死亡情況，并進(jìn)行細(xì)菌的分離。根據(jù)雞的死亡數(shù)確定分離株的致病性［1］：接種雞死亡率超過50%，定為高致病株；接種雞有死亡，但死亡率低于50%，定為中等致病株；接種雞96 h內(nèi)無死亡，定為低致病性分離株。

1.11 耐藥性檢測 參考美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）出版的抗菌藥物敏感試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中的藥敏試驗方法［6］，采用微量肉湯稀釋法對大腸桿菌分離株進(jìn)行耐藥性檢測，并以大腸桿菌ATCC25922和ATCC35218為質(zhì)控菌株。本研究中所用抗菌藥物的種類、相應(yīng)的測定濃度及藥敏試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)見表1。中介菌株計入耐藥株范圍內(nèi)。

表1 抗菌藥物的種類、測定濃度及判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 從128份病死雞中，共分離到細(xì)菌103株。

2.2 生化反應(yīng) 經(jīng)生化鑒定，有96個分離株的生化反應(yīng)符合大腸桿菌的特征。

2.3 血清型鑒定 對分離鑒定的96株致病性大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，共鑒定出75株大腸桿菌的血清型，占分離菌株的78.13%。此外，有15個分離株未能定型，占分離菌株的15.62%；有6個分離株發(fā)生自凝，占分離菌株的6.25%。

75株定型的菌株分屬18種血清型（表2），優(yōu)勢血清型為 O78、O2、O18、O15、O88、O143，這 6 種血清型的菌株占定型菌株的64%。

表2 已定型的75個分離株的血清型

2.4 致病性試驗 雛雞接種大腸桿菌后96 h內(nèi)，有94個試驗組死亡率超過50%，另外2個試驗組的接種雞有死亡但死亡率低于50%，從接種后死亡雞體內(nèi)均能分離到接種菌。健康對照雞均健活。說明本次分離到的大腸桿菌有94株為高致病性大腸桿菌，其他2株為中等致病性大腸桿菌。高致病株引起接種雞高死亡率，致死比例多為4／5～5／5；中度致病株引起接種雞較低死亡率，致死比例為1／5～2／5。接種后 24 h以內(nèi)死亡的試驗雞眼觀病變主要表現(xiàn)為心包積液、氣囊混濁以及肝臟腫大、淤血；接種48 h以后死亡的試驗雞，可以見到纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎等典型病變。高致病性分離株引起試驗雞在接種后24 h內(nèi)出現(xiàn)死亡高峰。已定型的75個分離株的致病性試驗結(jié)果詳見表3。

表3 75株已定型大腸桿菌的致病性試驗結(jié)果

2.5 耐藥性檢測 96株大腸桿菌對20種藥物的敏感性檢測結(jié)果如表4。質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922、ATCC35218的測定結(jié)果均在質(zhì)控范圍內(nèi)，說明藥物敏感性檢測結(jié)果可靠。

在被測藥物中，75%以上的菌株對氨芐青霉素、阿莫西林、土霉素、痢菌凈、恩諾沙星等5種抗菌藥耐受，所有大腸桿菌分離株對土霉素均表現(xiàn)為耐藥；除此之外，還有50%以上的菌株對卡那霉素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、諾氟沙星、磺胺甲基異噁唑／甲氧芐啶以及粘菌素等7種抗菌藥表現(xiàn)為耐藥。除土霉素外，經(jīng)χ2檢驗，針對某種抗菌藥的敏感菌株在各地區(qū)的分布情況，存在一定差異，但總體差異不顯著（P＞0.05）。

表4 抗菌藥物敏感性試驗結(jié)果

2.6 大腸桿菌的多重耐藥性 96株大腸桿菌對被測的20種藥物存在不同程度的多重耐藥現(xiàn)象（圖1），受檢菌至少對4種藥物耐受；75%的受檢菌對9種及9種以上的被測藥物耐受，耐藥類型為10～14重耐藥的大腸桿菌所占比例最大，占受檢菌的58.33%。對被測藥物耐受種類最多的大腸桿菌有2株，耐藥類型為17重耐藥，占受檢菌的2.08%。96株大腸桿菌共有57種耐藥譜。

圖1 96株大腸桿菌多重耐藥類型圖

3 結(jié)果

3.1 一般認(rèn)為，禽源致病性大腸桿菌血清型最常見的為 O1、O2、O35和 O78［2］，本研究鑒定山東部分地區(qū)的優(yōu)勢血清型為 O78、O2、O15、O18、O88、O143，與國內(nèi)資料報道的山東地區(qū)的優(yōu)勢血清型有相吻合的部分，也有差異存在［7-10］。通過對省內(nèi)一些養(yǎng)禽場的跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，同一禽場同批發(fā)病禽群中存在多種血清型，且同一禽場在不同時期流行株的血清型也有所差異，不同禽場之間差異更大。因此，在大腸桿菌的免疫預(yù)防中，應(yīng)充分考慮其血清型的多樣性、易變性。本次試驗中血清型的鑒定為山東省禽大腸桿菌病的防制提供了理論依據(jù)。

3.2 據(jù)報道，某種抗菌藥物耐藥率的多少與區(qū)域內(nèi)該藥物的使用頻度成正比［11］。細(xì)菌長期接觸某種抗菌藥物所產(chǎn)生的選擇性壓力導(dǎo)致了耐藥性的產(chǎn)生［12］。本次試驗中受檢菌株對用藥歷史較久、應(yīng)用廣泛的常規(guī)抗菌藥物如土霉素、氨芐青霉素、恩諾沙星、痢菌凈、阿莫西林等耐藥嚴(yán)重。法定獸用抗菌藥中僅有使用頻率較低的阿莫西林／棒酸敏感率高。曾對大腸桿菌比較敏感的氟苯尼考、慶大霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星等在廣泛使用的過程中均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。除阿莫西林／棒酸以外，細(xì)菌對尚未批準(zhǔn)為獸用藥、使用頻率相對較低的頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、阿米卡星、加替沙星敏感率較高。

本研究的多重耐藥情況與劉遠(yuǎn)飛等的報道相近［13］，說明禽源致病性大腸桿菌的多重耐藥性在山東地區(qū)普遍存在。禽源致病性大腸桿菌多藥耐藥性產(chǎn)生的原因，與長期以來我國養(yǎng)禽業(yè)從業(yè)者對抗菌藥物的濫用有關(guān)［14］。通過對省內(nèi)一些規(guī)?；B(yǎng)禽場的跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，無指征投用抗菌藥物的現(xiàn)象普遍存在?？咕幬锏牟灰?guī)范使用導(dǎo)致了多藥耐藥性致病性大腸桿菌的散播［15］。

因此，規(guī)?；B(yǎng)禽場在加強(qiáng)飼養(yǎng)管理的同時，應(yīng)定期進(jìn)行大腸桿菌的分離鑒定和抗菌藥物敏感性的檢測。選用有針對性的菌株作為菌苗；根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選擇敏感藥物，且應(yīng)注意規(guī)范用藥，必要時可以進(jìn)行聯(lián)合用藥，以有效控制大腸桿菌病的流行。

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