劉先福，陳 立，李俊凱

1長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州434025;2中國科學(xué)院動物研究所，農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101

信息素(pheronmone)在協(xié)調(diào)社會性昆蟲個體之間的生理和行為活動及完成整個群體生存所必要的活動方面起著重要的作用，對于其完成認(rèn)同與集群、識別、生殖、報警和防御等社會性通訊尤為重要。根據(jù)螞蟻家族個體分工的不同，螞蟻信息素大致可分為3 類，即蟻后信息素(queen-produced pheromone)、工蟻信息素(worker-derived pheromone)和幼蟲信息素(brood-produced pheromone)(Rosen et al.，1996)。工蟻的主要功能是覓食、防御，所以工蟻釋放的信息素主要有兩大類:一種是由頭部上顎腺分泌的告警信息素(alarm pheronmone)，能讓蟻群免于外敵入侵而遭受侵害;另外一種是由腹部杜氏腺分泌的跟蹤信息素(trail pheronmone)，具有高效的覓食和招募功能(Wilson，1962)。這2 類信息素保證了工蟻個體間的信息交流。

通常在反擊過程中，告警信息素能夠加強(qiáng)螞蟻的移動速度和進(jìn)攻強(qiáng)度(Brown et al.，1970)。然而，對于螞蟻這種個體較小，且蟻巢內(nèi)相互交流較少的種群，告警信息素更多的是起到一個及時疏散成員的作用(Regnier ＆ Wilson，1969)。關(guān)于螞蟻告警信息素的化學(xué)成分研究已有大量報道(Bradsha et al.，1975;Hernandez et al.，1999;Wheeler et al.，1975)。第1 個告警信息素是從切葉蟻Atta texana Buckley 體內(nèi)提取、分離得到，其主要成分是4-甲基-3-庚酮(Moser et al.，1968)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，4-甲基-3-庚酮還能引起A.texana (Buckley)、A.robusta Borgmeier、A.bisphaerica Forel、A.capiguara Gon alves 和A.sexdens (L.)等5 種螞蟻的告警行為(Blum，1968;Moser et al.，1968;Riley et al.，1974)。而據(jù)研究報道，紅火蟻Solenopsis invicta Buren 的告警信息素的主要成分是2-乙基-3，6-二甲基吡嗪(Vandermeer et al.，2010)。

人工合成的2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)樣品的比例為45%:55%的2-乙基-3，6-二甲基吡嗪和其同分異構(gòu)體2-乙基-3，5-二甲基吡嗪的混合物(Sugimoto et al.，2006)。由于沒有紅火蟻告警信息素標(biāo)準(zhǔn)樣品純品，在利用告警信息素樣品做生物試驗(yàn)時，必須考慮到混合物的作用。這一對異構(gòu)體可在氣相色譜柱上分開，所以用氣相色譜—觸角電位聯(lián)用儀(GC-EAD)分析紅火蟻工蟻對告警信息素混合物中2 種化合物的電生理反應(yīng)時，就能驗(yàn)證紅火蟻告警信息素混合物中的有效成分，為進(jìn)一步研究告警信息素對紅火蟻告警行為的調(diào)控提供參考。紅火蟻告警信息素在紅火蟻體內(nèi)屬于極微量化合物，本試驗(yàn)擬用柱層析法分離大量紅火蟻浸提液，然后與標(biāo)準(zhǔn)樣品對比GC-MS 離子圖，以確定是否能得到紅火蟻告警信息素流分。

1 材料與方法

1.1 供試材料及儀器

1.1.1 供試蟲源 紅火蟻種群采自紅火蟻發(fā)生區(qū)廣東省廣州市及周邊幾個地區(qū)。從野外采回的紅火蟻，在實(shí)驗(yàn)室利用“水試管”提供清水和10%的蜂蜜水，每天每巢投放3 ～5 頭黃粉蟲Tenebrio molitor L.(呂利華等，2006)。

1.1.2 主要試劑及儀器 正己烷，色譜純，上海安譜科學(xué)儀器有限公司;丙酮，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司;2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;高純氮?dú)?、氦氣，北京千禧京城氣體銷售中心;聚四氟乙烯乳液，廣州興勝杰科技有限公司;硅膠柱，內(nèi)徑22 mm，北京欣維爾玻璃儀器有限公司;硅膠粉，300 ～400 目，青島海洋化工廠。氣相色譜儀GC7890A、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀GC-MS，7890A-5975C，美國Agilent Technologies 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅火蟻告警信息素分離分析 將200 g 紅火蟻工蟻置于-20 ℃的冰箱中冷凍60 min，用470 mL色譜純級正己烷浸提48 h，取出浸提液，加入30 g無水硫酸鈉，處理12 h 后取出，置于4 ℃冰箱冷藏待用。告警信息素標(biāo)品為2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪，濃度為1 μg·μL-1，溶劑為色譜純級正己烷。

取上述工蟻浸提液，用硅膠柱層析法(80.0 g，300 ～400 目硅膠載入直徑22 mm 層析柱)分離含有吡嗪的流分。用正己烷與丙酮按比例沖洗層析柱，每管收集2 mL 為1 個流分，然后用GC 測定每個流分 的化 學(xué)成 分(Chen ＆ Fadamiro，2009a、2009b)。柱層析分離所收集的流分樣品用Agilent 7890A 氣相色譜儀進(jìn)行分析，色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm film thickness，Agilent Technologies)，進(jìn)樣量1 μL，無分流進(jìn)樣。樣品檢測程序:進(jìn)樣口溫度230 ℃，程序升溫起始溫度50 ℃，以5 ℃·min-1的速率升至100 ℃，以10 ℃·min-1的速率升至240 ℃，保持4 min，總共分析時間30 min。檢測器為火焰離子檢測器(FID)，溫度260 ℃。將GC 色譜圖相同或相近的流分合并成1 個流分。同時進(jìn)一針標(biāo)準(zhǔn)樣品，通過對比GC 保留時間來確定吡嗪流分，然后將吡嗪流分濃縮至1 mL，進(jìn)行GC-MS 分析。用GC-MS 分析過柱收集到的吡嗪流分和告警信息素標(biāo)品混合物，對比2 組數(shù)據(jù)的離子峰和保留時間，確定樣品中吡嗪流分中的告警信息素成分。

1.2.2 紅火蟻告警信息素混合物氣相色譜—觸角電位聯(lián)用(GC-EAD)分析 EAG 試驗(yàn)所用緩沖液為Ringer's 生理鹽水，各組分配比為氯化鈉0.75 g，氯化鉀0.035 g，氯化鈣0.029 g，水100 g。將銀絲插入2 個電極中，挑選1 對端口較小的玻璃毛細(xì)管，作記錄和參比電極。

挑選1 頭體型較大的工蟻，放置在玻片上，用手術(shù)刀快速切下頭部，切口端與充滿Ringer's 生理鹽水的參比電極相連，觸角的尖端連接記錄電極。電極通過鍍氯化銀銀絲與信號放大器連接，信號通過探針監(jiān)測(PRG-3，Syntech?，the Netherlands)，用GC-EAD 軟件(Syntech?，the Netherlands)記錄和分析數(shù)據(jù)(Chen ＆ Fadamiro，2007)。

GC-EAD 分析色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱，進(jìn)樣量2 μL，無分流進(jìn)樣。色譜條件同1.2.1。測試的樣品為2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪，即告警信息素混合物，濃度1 μg·μL-1。程序結(jié)束后保存FID離子檢測圖與EAD 圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅火蟻告警信息素分離分析

紅火蟻工蟻浸提液通過硅膠柱層析分離，用正己烷和丙酮溶劑體系能夠分離得到告警信息素流分，經(jīng)過GC-FID 分析濃縮得到1 mL 吡嗪流分。對樣品中吡嗪流分和標(biāo)準(zhǔn)樣品中告警信息素混合物進(jìn)行GC-MS 分析，得到2 個樣品的GC-MS 總離子色譜圖(圖1)，色譜峰1 的質(zhì)譜圖見圖2。由圖1可知，提取物樣品中吡嗪流分的色譜圖中在11.45 min 出現(xiàn)了一個峰，經(jīng)質(zhì)譜鑒定以及與標(biāo)準(zhǔn)樣品對比保留時間，發(fā)現(xiàn)吡嗪流分中的峰1 和合成標(biāo)準(zhǔn)品混合物中峰1 是同一種化合物。通過比對文獻(xiàn)中合成吡嗪混合物的色譜圖出峰順序和含量比，確定峰1 是2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，峰2 是2-乙基-3，5-二甲基吡嗪(Sugimoto et al.，2006)。此結(jié)果說明，大量紅火蟻工蟻浸提液過柱能夠得到告警信息素的成分，但含量非常低。

圖1 紅火蟻工蟻浸提物中吡嗪流分(A)和告警信息素標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物(B)的總離子色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms of the pyrazinefraction of the body extract from workers of S.invicta (A)and synthetic alarm pheromone component mixture(B)

2.2 紅火蟻告警信息素標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物GC-EAD分析

紅火蟻工蟻對告警信息素混合物GC-EAD 反應(yīng)如圖3。合成告警信息素標(biāo)準(zhǔn)樣品為2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪的混合物，經(jīng)過GC-EAD 分析，發(fā)現(xiàn)紅火蟻工蟻對2 種化合物均有電生理反應(yīng)，其中活性高的為化合物1，活性低的為化合物2。與GCMS 離子圖譜比對，發(fā)現(xiàn)化合物1 為2-乙基-3，6-二甲基吡嗪，化合物2 為2-乙基-3，5-二甲基吡嗪。GC-EAD 結(jié)果證實(shí)紅火蟻工蟻對2-乙基-3，6-二甲基吡嗪(即告警信息素)的電生理反應(yīng)比對其同分異構(gòu)體2-乙基-3，5-二甲基吡嗪的反應(yīng)大。

圖2 2-乙基-3，6-二甲基吡嗪的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectra of 2-ethyl-3，6-dimethylpyrazine

圖3 紅火蟻工蟻對告警信息素標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物的GC-EAD 反應(yīng)Fig.3 GC-EAD analysis of S.invicta workers to the synthetic alarm pheromone component mixture

3 討論

本研究將大量紅火蟻浸提液經(jīng)硅膠柱層析分離，得到含告警信息素的流分，與2-乙基-3，5(6)-二甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)樣品的氣相色譜圖保留時間對比，確定告警信息素流分含有2-乙基-3，6-二甲基吡嗪。將標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物進(jìn)行GC-EAD 分析，紅火蟻工蟻對2-乙基-3，6-二甲基吡嗪的電生理反應(yīng)活性比對2-乙基-3，5-二甲基吡嗪的高。

由于告警信息素屬于小分子易揮發(fā)物質(zhì)，利用柱層析方法洗脫分離較難得到該組分，會讓大量的物質(zhì)揮發(fā)損失;另外，試驗(yàn)選用的紅火蟻是凍死之后的工蟻，紅火蟻在被凍死過程中可能會釋放告警信息素，也會影響告警信息素的提取效率。因此，下一步可改進(jìn)提取方法，如利用動態(tài)頂空吸附、固相微萃取等。另外，還可對已鑒定出來的告警信息素及一系列吡嗪類似物做電生理反應(yīng)及行為反應(yīng)測試，探討吡嗪類似物對紅火蟻行為的影響。

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