張美佳，張愛華，萬 歆，王新安，牟基偉

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003）

喉癌是耳鼻喉癌癥中發(fā)生率最高的一種，且喉癌的發(fā)生率還在逐年上升［1］。已有研究證實，喉癌及其他多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展都與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因存在一定的相關(guān)性［2，3］。通過對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的檢測可以對癌癥的分期分型等工作提供指導(dǎo)和幫助。因此，通過免疫組化法對比不同分期和分級的喉癌組織中survivin與caspase-7的表達(dá)變化，總結(jié)survivin與caspase-7的表達(dá)與喉癌的關(guān)系，對喉癌的檢測和治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

收集2011-12～2014-01經(jīng)病理證實的喉癌標(biāo)本72例，及正常喉部黏膜組織10例。其中I期患者2例，Ⅱ期患者14例，Ⅲ期患者27例（T1N1M0患者3例、T2N1M0患者4例、T3N0M0患者20例）Ⅳ期患者29例（T4N2M0患者2例、T4N3M0患 者2例、T4N1M0患 者6例、T4N0M0患 者19例）；聲門上型22例、聲門型41例、聲門下型9例。所有病理均為行放化療治療。

1.2 試劑

Survivin和caspase-7試劑盒均由上海生工公司提供。

1.3 檢測步驟

嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，對材料進(jìn)行取材、固定、包埋及脫水脫蠟等操作；使用3%H2O2孵育樣品10min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶；使用PBS 沖洗樣品后滴加封閉液孵育15min；滴加一抗，4℃過夜；使用PBS沖洗樣品后滴加二抗，37℃孵育15min；使用PBS沖洗樣品后滴加DAB顯色液，避光孵育5min。

1.4 結(jié)果判定

顯微鏡下觀察不同樣品的染色強(qiáng)度，survivin和caspase-7染色陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)以黃色或棕黃色為主。對染色層度進(jìn)行計分：無色計0分，淡黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分。每個樣品隨機(jī)選取5個不重復(fù)事業(yè)，計算陽性細(xì)胞所占比重及陽性計分，無陽性細(xì)胞計0分，0%～10%計1分，10%～50%計2分，50%～75%計3分，＞75%計4分。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法。P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 survivin和caspase-7在喉癌組織及正常組織中的表達(dá)

survivin及caspase-7在喉癌組織中的陽性率均與喉正常組織存在統(tǒng)計學(xué)極顯著差異（P＜0.01），見表1。

表1 survivin及caspase-7在不同組織中表達(dá)陽性率比較

由上表可知，在兩種蛋白的表達(dá)水平比較中發(fā)現(xiàn)，在喉癌組織中，survivin及caspase-7的表達(dá)陽性率均與喉正常黏膜組織存在極顯著差異（P＜0.01），其中survivin表達(dá)量顯著增加，caspase-7 表達(dá)量顯著降低。提示，survivin 及caspase-7的表達(dá)與喉癌的發(fā)生具有相關(guān)性。

2.2 survivin及caspase-7在喉癌組織中的表達(dá)與喉癌分級分期的關(guān)系

不同的喉癌的發(fā)生部位及不同分化程度喉癌組織中survivin及caspase-7的陽性率均存在顯著差異，見表2。

表2 survivin及caspase-7在喉癌組織中的表達(dá)與病理參數(shù)關(guān)系

由上表可知，survivin及caspase-7的陽性率在不同發(fā)病部位及不同臨床分期均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05，P＜0.01）。在不同部位的喉癌類型比較中發(fā)現(xiàn)，聲門下型的survivin陽性率最高而聲門型最低；而在caspase-7陽性率的比較發(fā)現(xiàn)，其在聲門型中的表達(dá)率最高，而聲門上型的表達(dá)率最低。在不同臨床分期的比較中發(fā)現(xiàn)，隨著臨床分期的升高，survivin的陽性率也隨之升高，而caspase-7則呈現(xiàn)相反的趨勢，隨著病情的嚴(yán)重，表達(dá)率逐漸下降。

2.3 survivin及caspase-7表達(dá)的相關(guān)性

在喉癌組織中，survivin及caspase-7的表達(dá)具有顯著相關(guān)性（r=0.631，P＜0.05），兩者呈負(fù)相關(guān)，見表3。

表3 survivin及caspase-7在喉癌組織中的表達(dá)相關(guān)性

由上表可知，survivin的表達(dá)與caspase-7的表達(dá)負(fù)相關(guān)，在喉癌組織中survivin陽性而caspase-7陰性的概率最高，說明在喉癌組織中普遍呈現(xiàn)survivin表達(dá)而caspase-7不表達(dá)的現(xiàn)象。且證實survivin的表達(dá)與caspase-7 的表達(dá)負(fù)相關(guān)?？勺鳛榕R床檢測依據(jù)。

3 討論

目前，對腫瘤的認(rèn)識已得到了巨大的發(fā)展，大部分研究者均認(rèn)為喉癌及其他種類的發(fā)生不僅是細(xì)胞的復(fù)制功能不受調(diào)控導(dǎo)致復(fù)制過快，其發(fā)生也與細(xì)胞凋亡比例降低相關(guān)［4］。Survivin是一種已知的功能最為強(qiáng)大的凋亡一直因子，與多種腫瘤的發(fā)生具有密切關(guān)系［5］。Survivin可抑制細(xì)胞凋亡途徑中的caspase-7蛋白活性發(fā)揮抗凋亡作用，其在多少惡性腫瘤組織中均有表達(dá)，而在正常組織中表達(dá)量極低或不存在表達(dá)［6］。而caspase-7蛋白則是細(xì)胞凋亡途徑中的重要蛋白之一，參與了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，當(dāng)caspase-7蛋白的表達(dá)及活性受到抑制時，細(xì)胞凋亡的發(fā)生便會受到抑制［7～9］。目前尚無研究對喉癌組織的Survivin及caspase-7的表達(dá)關(guān)系進(jìn)行研究，僅有對喉癌組織中survivin和VEGF的表達(dá)研究，或其他癌癥中survivin和caspase-7 的研究［10，11］。因此，研究Survivin及caspase-7在喉癌組織中的表達(dá)關(guān)系，對了解喉癌、治療喉癌具有重要意義。

研究證實，喉癌組織中的survivin 蛋白表達(dá)量顯著提高，提示survivin 表達(dá)量的升高可能是喉癌發(fā)生的原因之一，且通過不同臨床分期喉癌組織中survivin表達(dá)量的對比研究發(fā)現(xiàn)，隨著臨床分期的增加，患者survivin的表達(dá)量也隨之增加，這一結(jié)果與其在其他癌癥中的表現(xiàn)相符。而caspase-7的表達(dá)量則是與survivin相反，其在健康人群的喉組織中的檢測率為100%，提示其是細(xì)胞凋亡途徑中的重要組成部分，當(dāng)caspase-7的表達(dá)受到抑制時便會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。同時，研究對survivin以caspase-7的相關(guān)性研究證實了在喉癌組織中survivin的表達(dá)與caspase-7的表達(dá)負(fù)相關(guān)?？赡艿脑蚴莝urvivin的表達(dá)不僅抑制了caspase-7的活性，同時對caspase-7的表達(dá)產(chǎn)生了負(fù)面影響。

綜上所述，在喉癌組織中Survivin及caspase-7的表達(dá)與在正常組織細(xì)胞中存在有統(tǒng)計學(xué)極顯著差異（P＜0.05）。Survivin與caspase-7 的表達(dá)負(fù)相關(guān)，提示可能是survivin的過量表達(dá)不僅抑制了caspase-7 的活性，不同抑制了caspase-7的表達(dá)，從而導(dǎo)致了癌癥的發(fā)生。

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