張淑紅，朱金玲，張 虎，王茉琳，王長山，金岳雷，張金波

（佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）是指在染色體序列上由于單個核苷酸位置上存在的變異而引起的DNA 序列多態(tài)性，且在一個人群中發(fā)生頻率高于1%。SNP 是一種常見的遺傳變異形式，SN P 的存在是導(dǎo)致個體之間、人種之間差異的原因之一。人體內(nèi)的DNMT 基因呈單核苷酸多態(tài)性，發(fā)生在啟動子區(qū)的SNP可影響基因的表達(dá)或引起酶活性的改變，并能改變相應(yīng)的DNMT蛋白的結(jié)構(gòu)和功能［1］，進(jìn)而與腫瘤的發(fā)生機(jī)制有著密切的關(guān)系。

表觀遺傳學(xué)是研究DNA 序列沒有變化，但是產(chǎn)生了可遺傳的表達(dá)改變，包含DNA 甲基化、基因組印記、染色質(zhì)組蛋白修飾、隔離蛋白以及非編碼RNA 調(diào)控等方式。DNA 甲基化是由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）介導(dǎo)的，目前發(fā)現(xiàn)有活性的DNMTs有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。一般認(rèn)為它們?nèi)呤菂f(xié)同作用的，共同使基因組產(chǎn)生新的甲基化型并維持已經(jīng)形成的甲基化表型。DNMT1 主要參與甲基化狀態(tài)的維持，并與甲基化狀態(tài)的延伸有關(guān)；DNMT3 包括DNMT3a、DNMT3b，以及DNMT3L 等，DNMT3A和DNMT3B主要是起從頭甲基化的作用，而DNMT2的功能尚不明確。DNMT3B在腫瘤的發(fā)生中起到重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)DNA 從頭甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B在膀胱癌，結(jié)腸癌，胃癌，肝癌等腫瘤組織中都存在明顯的高表達(dá)［2］。由于DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶在腫瘤發(fā)生中起著重要作用，近年來一直受到研究者的青睞。

SNP、DNA 甲基化與腫瘤三者之間的關(guān)系就已經(jīng)有相關(guān)報道［3］。研究結(jié)果表明DNA 甲基化能產(chǎn)生SNP位點(diǎn)，而SNP位點(diǎn)同樣能產(chǎn)生新的DNA 甲基化位點(diǎn)，并可能對相應(yīng)基因的DNA 甲基化狀態(tài)有調(diào)控作用，影響其功能的發(fā)揮，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程。已有的研究結(jié)果提示，SNP能夠通過DNA 甲基化相關(guān)酶類來影響腫瘤發(fā)生的易感性。在DNMT3B 基因中也發(fā)現(xiàn)了一些SNP位點(diǎn)，盡管這些SNP的功能尚不明了，但其中一些SNP能夠影響DNMT3B 的活性，改變?nèi)祟悓Ψ伟?、乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤的易感性。本研究選擇佳木斯地區(qū)漢族人群胃癌病例組和正常對照組，探討DNMT3B 基因啟動子區(qū)SNP-579G／T位點(diǎn)與胃癌發(fā)病易感性之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

病例組血樣選自佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院、佳木斯市腫瘤醫(yī)院的胃癌血液樣本50例，其中男30例，女20例。血液標(biāo)本采集前均沒有抗腫瘤藥物的使用記錄。對照組為健康人血液樣本60例，男35例，女25例。其中性別、年齡等與病例組相匹配，見表1。兩組人群都是佳木斯地區(qū)漢族人群，個體之間均無血緣關(guān)系，無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 全基因組DNA 提取：采集靜脈全血2mL，運(yùn)用DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，分別提取病例組、對照組外周血，4℃保存。

1.2.2 PCR：引物序列如下：上游5’CAGGTCTCATTATGCCTAGG-3’（nt 1533753— 1533772），下 游5’GGGAGCTCACCTTCTAGAAA-3’（1533977—1533958），擴(kuò)增產(chǎn)物225bp。單管反應(yīng)體系25μL包含dNTPs 0.1mmol.L-1，上下游引物各10pmol，Taq DNA 聚合酶1.25U，DNA 1.0μL（100ng）。95℃預(yù)變性5min；95℃20s，56℃20s，72℃20s共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察。

1.2.3 限制性內(nèi)切酶pvuⅡ酶切反應(yīng)：20μL 酶切反應(yīng)體系含10×Buffer 2.0μL，pvuⅡ（TaKaRa公司）4U，PCR 產(chǎn)物2.0μL，混勻后37 ℃水浴中酶切過夜。酶切產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。

1.2.4 選擇凝膠電泳證實(shí)為GT 基因型，測序。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，計算P值、the odd ratios（ORS）和95%confidence intervals（CI）。

2 結(jié)果

2.1 PCR-RFLP分析DNMT3B基因啟動子區(qū)SNP位點(diǎn)（-579G／T），PCR 產(chǎn)物225bp，Maker為DL2000，見圖1。經(jīng)限制性內(nèi)切酶pvuⅡ酶切，酶切產(chǎn)物為132bp和93bp，部分結(jié)果見圖2。

圖1 PCR 產(chǎn)物電泳圖1：maker；2～9：PCR 產(chǎn)物

圖2 -579G／T 酶切產(chǎn)物圖1～5：酶切產(chǎn)物；6：maker

2.2 -579G／T 位點(diǎn)PCR-RFLP 分型結(jié)果經(jīng)測序驗(yàn)證，利用BLAST 與基 因DNMT3B 全 序 列（GeneID：1789 NC000020.9）進(jìn)行比對，見圖3～4。

圖3 GT 雜合子測序圖

圖4 TT 純合子測序圖

2.3 -579G／T 位點(diǎn)在胃癌病例組和正常對照組中基因型分布無顯著性差異P＞0.05，見表2，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)驗(yàn)證兩個群體均為遺傳平衡群體。-579G／T 位點(diǎn)與胃癌發(fā)病風(fēng)險估計無統(tǒng)計學(xué)意義：P＞0.05，OR（95%CI）=0.65（0.41-1.03）。

表2 DNMT3B（-579G／T）肺癌組和正常對照組基因型和基因頻率分布

3 討論

SNP是指DNA 多態(tài)性在人群中的分布頻率大于1%的可遺傳性的變異。研究表明，位于基因啟動子區(qū)的SNP 能影響基因的表達(dá)或酶的活性［4］。本研究所得DNMT3B基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-579G／T 在病例組中的分布GT 基因型為14%，TT 基因型為86%；正常對照組中GT 基因型為20%，TT 基因型為80%，兩者間無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，OR=0.65，95%CI為0.41-1.03），該位點(diǎn)與佳木斯地區(qū)胃癌的易感性無顯著相關(guān)性。

DNMT3B基因的SNP 位點(diǎn)與疾病的關(guān)聯(lián)研究已見報道，目前集中在某單個的位點(diǎn)及某些單體型的研究，且各個位點(diǎn)在人群中基因型的分布及SNP位點(diǎn)與疾病的相關(guān)性具有民族性、區(qū)域性的差異。文獻(xiàn)報道表明DNMT3B 啟動子區(qū)C46359T 的CT+TT 基因型所患肺癌的風(fēng)險幾乎是CC基因型的兩倍［5］；Hu等［6］采用PCR-RFLP和DNA 測序的方法，對259例胃癌患者和262 位健康對照人群的DNMT3B啟動子區(qū)SNP-149C／T和-579G／T 位點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，-579G／T 位點(diǎn)與胃癌易感性相關(guān)，攜帶G 等位基因的個體較TT 基因型個體患胃癌的易感性低，且該位點(diǎn)基因型在中國人、韓國人和美國人中的分布不同。由此可說明，基因多態(tài)性因人群、種族以及地域分布的不同而存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致不同人群對腫瘤易感性的差異。Srivastava k等［7］研究表明DNMT3B啟動子-579G／T 位點(diǎn)與印度北部地區(qū)膽囊癌的易感性無顯著相關(guān)性。Zhensheng Liu等［8］在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的研究中，進(jìn)行了DNMT3B 啟動子區(qū)SNP-149C／T和-579G／T 位點(diǎn)分析，結(jié)果表明-149TT 基因型與頭頸鱗狀細(xì)胞癌有較高的相關(guān)性；-579G／T 對此腫瘤無明顯相關(guān)性，但兩個SNP 共同作用增加了此腫瘤發(fā)病的風(fēng)險。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中表明，DNMT3B基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)-149C／T 與本地區(qū)肺癌的發(fā)生無相關(guān)性［9］。在研究DNMT3B基因啟動子區(qū)-149C／T位點(diǎn)的基礎(chǔ)上繼續(xù)研究-579G／T 位點(diǎn)，也是對DNMT3B 基因的SNP-579G／T 多態(tài)性在佳木斯地區(qū)基因型分布及其與胃癌發(fā)生關(guān)系的初步探索，由于樣本量不大，再加上有些基因型在人群中的分布比例較小，所以不能完全確定DNMT3B 基因-579G／T 多態(tài)性與胃癌的發(fā)生無關(guān)。需要在此實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上繼續(xù)加大樣本進(jìn)行按吸煙、病情分期、分層來探討兩者間的關(guān)系，同時需要做SNP 單體型的研究。至于該基因的SNP位點(diǎn)與其它腫瘤易感性的關(guān)系，尚需進(jìn)行更深入的研究，加以闡明。

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