劉 聲 劉曉燕 郭霞珍

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科，北京，100029;2北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

“肺與大腸相表里”是中醫(yī)臟象學(xué)中最為重要的理論之一。肺與大腸通過經(jīng)絡(luò)的聯(lián)系，構(gòu)成了臟腑陰陽表里兩經(jīng)的絡(luò)屬關(guān)系;在生理功能上緊密聯(lián)系，病變上也相互影響[1－2]?，F(xiàn)代組織胚胎學(xué)發(fā)現(xiàn)肺、大腸的上皮組織均來源于原腸胚之內(nèi)胚層，其中肺來自于內(nèi)胚層前段;腸來自于內(nèi)胚層中、后段;同時(shí)認(rèn)為上皮組織及細(xì)胞又是二者的主要功能單位，是最能代表消化道和呼吸道功能的單位，因此被作為研究的重點(diǎn)[3]。本實(shí)驗(yàn)利用形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞分析技術(shù)，從上皮組織細(xì)胞形態(tài)和增殖凋亡動(dòng)靜兩方面對(duì)人胚胎發(fā)育各個(gè)時(shí)期的“肺”與“大腸”上皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，以期能為中醫(yī)理論中肺與大腸相互關(guān)系提供借鑒與參考。另外，膀胱亦發(fā)育于內(nèi)胚層，且在水液代謝功能上與肺有密切聯(lián)系，因此，設(shè)為對(duì)照組。

1 材料與方法

1.1 胚胎肺腸及膀胱來源 選擇胎齡9周至出生前，自愿終止妊娠病例，經(jīng)人工流產(chǎn)或水囊引產(chǎn)獲得引產(chǎn)的人胚胎，置4℃冰箱存放，待制備。來自于平谷中醫(yī)院，并經(jīng)過倫理委員會(huì)審查。按人肺胚胎的發(fā)育過程分為腺狀期(9～16周)、小管期(17～24周)和原始肺泡形成期(25 周至出生)[4]。

1.2 器官組織的處理 操作均在無菌細(xì)胞室內(nèi)超凈臺(tái)上進(jìn)行。分別用碘酒、酒精消毒胚胎胸、腹部皮膚，自臍帶上方行橫切口，打開胸、腹部。

1.2.1 組織及細(xì)胞形態(tài)觀察 1)取出肺臟，經(jīng)生理鹽水洗三遍，一側(cè)肺(實(shí)驗(yàn)中取左側(cè))橫斷切成厚約1 mm組織塊，立即投入4%多聚甲醛溶液固定，乙醇脫水，石蠟包埋，HE染色，觀察組織細(xì)胞形態(tài)。另一側(cè)肺(右側(cè))備用。2)取出整腸，截取結(jié)腸前段，經(jīng)生理鹽水洗三遍，橫斷切成長(zhǎng)約0.5 cm的腸段，取其中1～2段投入4%多聚甲醛溶液固定，乙醇脫水，石蠟包埋，切片4 μm，HE染色，觀察組織細(xì)胞形態(tài)。其余備用。3)膀胱組織處理同腸。

1.2.2 細(xì)胞懸液制備 取備用肺、結(jié)腸組織，刮取黏膜上皮，剪成1 mm2大小的組織塊，胰酶消化，離心純化，在加有10%小牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲得原代上皮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，70%冷乙醇固定，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增值、凋亡，并計(jì)算增值率與凋亡指數(shù)，作為評(píng)價(jià)細(xì)胞生物學(xué)特性的依據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用數(shù)理統(tǒng)計(jì)軟件SPSS處理。結(jié)果采用(±s)形式表示，上皮組織免疫組化表達(dá)組間比較采用方差分析;組間增值率與凋亡指數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)期肺、腸及膀胱上皮細(xì)胞形態(tài)

2.1.1 9～16周胚胎肺、腸上皮細(xì)胞形態(tài) 肺與腸上皮均由柱狀上皮細(xì)胞構(gòu)成，而膀胱上皮由多層立方和扁平上皮細(xì)胞構(gòu)成。

2.1.2 17～24周胚胎肺、腸及膀胱上皮組織及細(xì)胞形態(tài) 肺上皮主要由單層立方上皮細(xì)胞[5]。腸表面覆蓋單層柱狀上皮，有指狀絨毛突。膀胱上皮由多層立方和扁平上皮細(xì)胞構(gòu)成。這一期肺的上皮組織轉(zhuǎn)化為立方上皮組織，腸仍為柱狀上皮組織，膀胱未變。

2.1.3 25周后胚胎肺、腸及膀胱上皮組織及細(xì)胞形態(tài) 肺:肺實(shí)質(zhì)內(nèi)細(xì)胞呈扁平，鄧錦波[6]等電鏡下觀察認(rèn)為為Ⅰ型和Ⅱ型扁平上皮細(xì)胞，腸表面覆蓋單層柱狀上皮，有指狀絨毛突。膀胱仍由上皮由多層立方和扁平上皮細(xì)胞構(gòu)成。這一期肺的上皮組織轉(zhuǎn)化為Ⅰ型和Ⅱ型扁平上皮，腸仍為柱狀上皮，膀胱未變。

2.2 不同時(shí)期肺、腸及膀胱上皮細(xì)胞增殖、凋亡檢測(cè)第一期肺與空腸、回腸、結(jié)腸、膀胱出現(xiàn)明顯的增殖峰，而直腸增殖峰較之不明顯;G1前凋亡峰肺、空腸、回腸、結(jié)腸均不明顯，膀胱明顯增高，直腸次之。

圖1 第一期各器官組織形態(tài)(HE)

1)第一期肺與空腸、回腸、結(jié)腸上皮組織細(xì)胞增殖凋亡水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與直腸、膀胱存在的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如表1、圖1所示。

2)第二期空腸、回腸、結(jié)腸、膀胱出現(xiàn)明顯的增殖峰，而肺增殖峰較之不明顯;G1前凋亡峰肺、空腸、回腸、結(jié)腸均不明顯，膀胱明顯增高，直腸次之。第二期肺與空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱上皮組織細(xì)胞增殖水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如表2、圖2所示。

圖2 第二期各器官組織形態(tài)(HE)

3)第三期空腸、回腸、結(jié)腸、膀胱出現(xiàn)明顯的增殖峰，而肺增殖峰較之不明顯;G1前凋亡峰膀胱仍明顯較高，肺、空腸、回腸、結(jié)腸直腸次之。第三期肺與空腸、回腸、結(jié)腸、直腸、膀胱上皮組織細(xì)胞增殖凋亡水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。如表3、圖3所示。

圖3 第三期各器官組織形態(tài)(HE)

3 討論

細(xì)胞的凋亡和增殖活動(dòng)在器官形態(tài)發(fā)生中都是必不可少的重要組成部分。細(xì)胞的凋亡與增殖行為在胚胎器官的發(fā)育過程中廣泛存在[6－7]，細(xì)胞分裂增殖和細(xì)胞凋亡之間的動(dòng)態(tài)平衡，可維持組織細(xì)胞群落的穩(wěn)定，以及維持機(jī)體的正常發(fā)育和自身穩(wěn)定。細(xì)胞增殖是細(xì)胞新生的過程，細(xì)胞凋亡則是細(xì)胞正常退化、死亡的過程。這種看來截然相反的兩個(gè)行為，在胚胎器官發(fā)育過程中卻同時(shí)存在，并且增殖活躍的同時(shí)出現(xiàn)凋亡的活躍，反之亦然。它們相互影響，相互制約，很好地維持著動(dòng)態(tài)的平衡，精細(xì)地調(diào)控著器官發(fā)育，在保證胚胎器官形態(tài)的正常發(fā)生、發(fā)展及初步形成三階段中起著十分重要的作用。

表1 第一期各器官增殖與凋亡指數(shù)(±s)

表1 第一期各器官增殖與凋亡指數(shù)(±s)

注:與肺相比，*P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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表2 第二期各器官增殖與凋亡指數(shù)(±s)

表2 第二期各器官增殖與凋亡指數(shù)(±s)

注:與肺相比，*P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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表3 第三期各器官增殖與凋亡指數(shù)(±s)

表3 第三期各器官增殖與凋亡指數(shù)(±s)

注:與肺相比，*P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

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另外，胚胎發(fā)育過程發(fā)生的細(xì)胞增殖與凋亡，并不是隨機(jī)出現(xiàn)的，而是發(fā)生在胚胎發(fā)育過程特定部位和特定時(shí)間，并有著嚴(yán)格的時(shí)空程序的[8－9]，9 ～16周是胚胎肺與大腸由胚芽發(fā)展為器官雛形的關(guān)鍵時(shí)期，可以定義為兩器官的發(fā)生時(shí)期。喉氣管憩室在反復(fù)分支的同時(shí)，支氣管樹呼吸部發(fā)育，由柱狀上皮形成管壁厚而管腔狹窄的上皮性支氣管樹。與此同時(shí)，各腸段雛形基本出現(xiàn)，內(nèi)襯由單層柱狀上皮構(gòu)成的腸黏膜[10]。因此，通過對(duì)比胚胎發(fā)育早期肺與大腸的主要功能細(xì)胞－上皮細(xì)胞的增殖與凋亡，可以明確胚胎肺與大腸發(fā)生時(shí)相上的同一性;并加上對(duì)比兩器官發(fā)育早期上皮組織細(xì)胞形態(tài)特征，以期能為肺與大腸組織發(fā)生上的同源性提供例證，并能為中醫(yī)理論中肺與大腸相互關(guān)系提供借鑒與參考;為現(xiàn)代研究手段運(yùn)用于中醫(yī)學(xué)研究提供思路;探索一條從組織發(fā)生學(xué)角度對(duì)臟象本質(zhì)進(jìn)行認(rèn)識(shí)的重要途徑。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:胚胎早期(9～16周胎齡)，“肺”與“空腸、回腸、結(jié)腸”在上皮組織及細(xì)胞形態(tài)一致，上皮細(xì)胞增殖、凋亡的生物學(xué)特性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);胚胎中期(17～23周)、胚胎晚期(24周至出生)“肺”與“腸”上皮組織及細(xì)胞形態(tài)不一致，上皮細(xì)胞增殖、凋亡的生物學(xué)特性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

綜合以上可以看出，從組織形態(tài)與增殖凋亡的細(xì)胞生物學(xué)特性層面分析，胚胎發(fā)育早期肺與腸在組織發(fā)生學(xué)上無差異。因此，胚胎早期的“無差異”可以為“肺”與“空腸、回腸、結(jié)腸”同源發(fā)生提供一定的依據(jù)。另外，“肺與大腸相表里”的成體肺腸相關(guān)雖主要是功能之間的相互聯(lián)屬，但可能與其原始的同源性相關(guān)。

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