杜秋香，宋麗娟，張凌宇，李三強，王亞芳，孫俊紅，王英元*

(1山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，太原 030001;2山西省太原市公安局杏花嶺分局;*通訊作者，E-mail:wyy580218@163.com)

轉(zhuǎn)運蛋白是定位在細胞質(zhì)膜和細胞器膜上的、能轉(zhuǎn)運糖、氨基酸、無機鹽離子和藥物等重要成分進出細胞的跨膜蛋白的總稱。細胞中主要的轉(zhuǎn)運蛋白有離子通道(ion channel)、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、水通道(aquaporin)、鈉/鉀離子泵、溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(solute carrier，SLC)等［1］。溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白(SLC)是細胞內(nèi)最大的一類轉(zhuǎn)運蛋白，也是細胞膜上僅次于G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor，GPCR)超家族的第二大類細胞膜蛋白。He等［2］認為SLC超家族分為55個家族，包含至少362個成員。SLC1A1是溶質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白第一家族的第一位成員，也叫做興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運體3(excitatory amino acid transporter 3，EAAT3)或者 EAAC1(excitatory amino acid carrier 1)［3］。在前期的研究中通過對肌肉損傷后4 h和8 h與正常對照組肌肉的mRNA差異表達研究發(fā)現(xiàn)，SLC1A1 mRNA在損傷后存在表達差異。因此，本實驗通過建立不同損傷時間大鼠骨骼肌損傷動物模型，采用real-time PCR方法以Rpl13 mRNA作為內(nèi)參基因［4］，測定損傷后肌肉組織中 SLC1A1 mRNA相對表達量變化，研究其與損傷時間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

78只健康成年SD大鼠(體重250－300 g)，隨機分為正常對照組和肌肉損傷 4，8，12，16，20，24，28，32，36，40，44，48 h 組，每組6 只。

1.2 肌肉損傷模型制備

3%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.13 ml/100 g體重)麻醉:①將損傷組大鼠置于自制固定裝置，使250 g重力錘從150 cm高度自由落下，造成大鼠右后肢股四頭肌處肌肉挫傷后，按分組分別于挫傷后4 h，8 h，12 h，16 h，20 h，24 h，28 h，32 h，36 h，40 h，44 h，48 h將大鼠頸椎脫臼處死，并快速于挫傷處取50 mg肌肉組織置于液氮中保存?zhèn)溆?②對照組大鼠直接頸椎脫臼處死，取與損傷組大鼠相同部位肌肉組織保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

總RNA提取嚴格按Promega公司SV Total RNA Isolation System(SV總RNA純化系統(tǒng))試劑盒操作說明書進行，并用Agilent公司2100生物分析儀對總RNA進行完整性檢測及濃度測定。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用 TAKARA公司 Prime Script RT-PCR Kit，10μl反轉(zhuǎn)錄體系內(nèi)總RNA含量為0.4μg，反應(yīng)液配制和反應(yīng)條件按試劑盒要求操作。完成后－20℃保存。

1.4 實時定量PCR擴增反應(yīng)體系及程序

PCR擴增在Stratagene公司Mx3000P實時熒光定量PCR儀上進行，PCR反應(yīng)液購買于TAKARA公司的Premix Ex Taq(Probe qPCR)。對照組和不同損傷時間組cDNA樣本各取2.0μl加入25.0μl的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 s，1個循環(huán);第二階段:95℃，5 s，60 ℃，20 s，終點采集熒光信號，共40個循環(huán)。對內(nèi)參基因Rpl13 mRNA和目的基因SLC1A1 mRNA進行同時擴增，并以Rpl13 mRNA的表達量進行各組間SLC1A1 mRNA表達量的均一化處理，由Stratagene MxPro QPCR軟件自動輸出相對差異表達量。

SLC1A1和Rpl13的cDNA序列子Genebank下載后采用AlleleID 6.0軟件進行引物設(shè)計，并經(jīng)NCBI上BLAST比對后用于real－time PCR檢測。引物信息見表1，所有引物均由Invitrogen公司合成。

表1 實時熒光定量PCR引物和探針Table 1 Sequences of PCR primer and probe

1.5 標準曲線

為測定SLC1A1 mRNA與內(nèi)參基因Rpl13 mRNA的擴增效率，cDNA溶液按10倍梯度稀釋，再將相當(dāng)于0.01，0.1，1.0，10，100 ng 總 RNA 量的 cDNA作為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，由Stratagene MxPro QPCR軟件自動分析并輸出標準曲線。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實時定量PCR結(jié)果由熒光定量分析儀自動采集給出目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，基因表達量采用實驗組/對照組=2－ΔΔCt進行計算，其中 ΔΔCt=ΔCt實驗－ΔCt對照。由于每組中目的基因和內(nèi)參基因加入的量是一致的，所以可以對每個樣本ΔCt值(=Ct目的－Ct內(nèi)參)采用 SPSS10.0 統(tǒng)計軟件進行組間比較后再進行2－ΔΔCt計算表達量。

2 結(jié)果

2.1 總RNA完整性檢測及定量

采用Agilent2100生物分析儀進行的總RNA檢測，其橫坐標表示保留時間，縱坐標表示熒光強度。本實驗提取的總RNA，其完整性指數(shù)(RNA integrity number，RIN)=8.6(圖1，見第341 頁)，在28S 峰值后再沒有其他雜帶峰出現(xiàn)，說明沒有基因組DNA的污染，其中總 RNA 濃度為 58 ng/μl，18S∶28S=1.1。

2.2 相對定量的標準曲線

將相當(dāng)于0.01－100 ng總RNA量的cDNA作為模板，進行實時定量PCR擴增，制作標準曲線(圖2)。從圖2可知，SLC1A1和Rlp13的標準曲線和兩者的擴增效率基本一致。

圖1 Agilent 2100生物分析儀檢測總RNA的完整性及濃度Figure 1 Total RNA integrality and density by Agilent 2100 bioanalyzer

圖2 SLC1A1與Rlp13的標準曲線Figure 2 The standard curve of SLC1A1 and Rlp13

2.3 SLC1A1 mRNA在大鼠肌肉組織挫傷后不同時間點相對表達

肌肉組織挫傷后SLC1A1 mRNA表達量變化幅度非常大，損傷后4 h即有所升高，8 h達到峰值，最高為正常對照組的19倍，隨著損傷后時間延長，其表達量逐漸回落，但是在24 h以內(nèi)依然是對照組的11倍以上(見圖3)。24h以后，SLC1A1 mRNA表達急劇降低，直至48h降低為接近正常對照組水平。這一結(jié)果與篩選差異表達基因的結(jié)果相一致。

圖3 肌肉損傷后不同時間點SLC1A1 mRNA相對表達量Figure 3 The relative expression of SLC1A1 mRNA in contused skeletal muscle of rat at different time

3 討論

目前國內(nèi)外對于損傷時間的研究主要集中在腦損傷和皮膚切創(chuàng)傷。通過對膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、S100、iNOS等蛋白及 slit2 mRNA的研究［5］，發(fā)現(xiàn)這些因子在腦損傷后隨時間呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律。通過對皮膚損傷局部組織中p38MAPK、JNK、calpain、caspases、NOS、纖維連接蛋白、IL－1α、IL－1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF－α)細胞間黏附分子1(ICAM－1)、ICAM－2、、核轉(zhuǎn)錄因子(NF－κB)、P 選擇素、Beclin1、LC3 等諸多細胞因子［6－8］進行研究，發(fā)現(xiàn)這些細胞因子在皮膚切創(chuàng)后有不同程度的表達，而且隨著損傷時間的延長，呈現(xiàn)一定的時間相關(guān)性，為法醫(yī)病理學(xué)推斷損傷時間提供了一些客觀的依據(jù)。但對于在損傷類型中占絕大多數(shù)，且經(jīng)常伴隨其他損傷方式存在的肌肉挫傷僅有少量的報道。本實驗通過建立大鼠肌肉挫傷模型，應(yīng)用實時定量PCR的方法研究SLC1A1 mRNA在肌肉挫傷后的表達規(guī)律。

氨基酸是機體內(nèi)重要的小分子極性物質(zhì)，不能自由通過細胞膜，需要細胞膜上相應(yīng)轉(zhuǎn)運蛋白的協(xié)助才能完成轉(zhuǎn)運。根據(jù)轉(zhuǎn)運載體的底物特異性和動力學(xué)特性，目前已經(jīng)確定的氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)有15種以上。其中酸性氨基酸轉(zhuǎn)運載體的X－AG系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運蛋白主要有 5種，分別為 EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4、EAAT5［9］。這類轉(zhuǎn)運系統(tǒng)雖然主要在腦部組織中存在，但是SLC1A1(EAAC1，EAAT3)與其他興奮性氨基酸載體不同，它不是神經(jīng)特異性，SLC1A1在多種組織中都有發(fā)現(xiàn)，比如胃、肝臟、腎、胰腺［10］，而且在體內(nèi)各器官分布也較均一。SLC1A1首先是一種高親和力的谷氨酸轉(zhuǎn)運載體，在保持細胞外谷氨酸濃度，防止興奮過度和興奮性中毒方面起關(guān)鍵作用［11］，而且SLC1A1可以通過神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達并作用于非神經(jīng)組織中，本實驗結(jié)果證實:在正常大鼠骨骼肌中有一定數(shù)量的SLC1A1 mRNA表達，挫傷后4 h SLC1A1 mRNA的表達開始上升，8 h達高峰，直至24 h內(nèi)一直處于表達的高位，之后逐漸回落至48 h接近正常對照組，這可能是由于骨骼肌損傷后，作為機體重要能量來源的必需氨基酸—谷氨酸及其他氨基酸在損傷局部的大量釋放，刺激SLC1A1的表達升高至損傷愈合的最初24 h內(nèi)。類似的結(jié)果在老年癡呆癥患者的腦組織［12］與急性腦缺血損傷大鼠神經(jīng)元［13］等其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病中均有出現(xiàn)，但是肌肉組織中的表達尚未見報道，本次實驗不僅對推斷肌肉挫傷時間提供了一個可能的指標，同樣為肌肉組織中SLC1A1(EAAC1，EAAT3)的表達提供了實驗依據(jù)。

此外，以上研究結(jié)果提示，實時定量PCR具有高度的靈敏性、準確的定量性以及良好的重復(fù)性，通過該法檢查SLC1A1 mRNA的變化情況，并結(jié)合其他形態(tài)學(xué)的變化，對于損傷時間的推斷有一定的幫助作用。

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