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        蠅蕈醇激動GABAC受體對青霉素致大鼠癲癇的影響

        2014-11-21 07:38:56范彥英廖玉芳張艷欣王明正
        關(guān)鍵詞:阻斷劑?;撬?/a>荷包

        范彥英,廖玉芳,肖 奕,張艷欣,王明正

        (山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室,太原 030001;*通訊作者,E-mail:wang5695695@163.com)

        癲癇是一組以大腦神經(jīng)元同步異常興奮放電引起發(fā)作性、短暫性與刻板性腦功能異常的綜合征,為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)最常見的慢性腦部疾病之一。目前我國癲癇患者人數(shù)已經(jīng)超過1 000萬,且每年新發(fā)癲癇病人在40萬左右。由于癲癇的發(fā)病機制仍未完全闡明,給癲癇的防治工作進展帶來一定困難。

        根據(jù)癲癇發(fā)作具有突發(fā)性,且能夠自行緩解或自行終止發(fā)作這一規(guī)律可以認為,人類腦內(nèi)存在“內(nèi)源性抗癲癇系統(tǒng)”[1]。大量的研究表明,γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是具有抗癲癇作用的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子,其可作用于氯離子通道型的GABAA和 GABAC受體及代謝型的 GABAB受體[2,3]。已有的研究證實,在癲癇發(fā)作和自行終止過程中,GABAA和GABAB受體發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用。如DeLorey等[4]發(fā)現(xiàn)GABAA受體β3亞基缺失的小鼠可出現(xiàn)異常腦電和癲癇發(fā)作,而人類家族性癲癇的發(fā)作也與GABAA受體亞基的變異有關(guān)[5]。另有研究表明,GABAB受體缺失的小鼠,可自發(fā)形成類似失神性癲癇患者的棘波,棘慢波[6],GABAB受體的表達或功能的異??赡艽龠M大鼠原發(fā)性癲癇的形成[7]。GABAC受體雖與GABAA受體同屬配體門控型氯離子通道,但與GABAA受體相比,GABAC受體對GABA具有更高的敏感性,也擁有更持久的開放時間,介導(dǎo)的內(nèi)向氯離子電流緩慢而持久[8]。此外,其對GABAA受體的調(diào)節(jié)劑如巴比妥類,苯二氮類,GABAA受體的典型阻斷劑荷包牡丹堿(bicuculline)以及GBABB受體激動劑巴氯芬等不敏感[9]。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn),在電刺激大鼠坐骨神經(jīng)和青霉素(penicillin)協(xié)同誘發(fā)癇性放電模型中,GABAC受體的 ρ2亞基 mRNA 表達減少[10],但GABAC受體對于癲癇發(fā)作和終止的影響尚不明確。

        為此,本實驗采用青霉素誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作模型,以GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿、GABAB受體阻斷劑高?;撬?homotaurine)和GABAC受體激動劑蠅蕈醇(muscimol)為工具藥,探討GABAC受體在內(nèi)源性抗癲癇機制中的作用。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物和主要試劑

        健康清潔級SD大鼠共144只,體重180-220 g,均由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。所有實驗動物均遵照國家實驗動物飼養(yǎng)和使用指南,動物飼養(yǎng)在溫度控制的環(huán)境(22-25℃)下,12 h明暗循環(huán),自由飲食和飲水。荷包牡丹堿、高?;撬岷拖夀Υ季徲赟igma公司;青霉素購于華北制藥股份有限公司;烏拉坦購于成都化學(xué)試劑廠;氯化鈉注射液購于石家莊四藥有限公司。

        1.2 皮層定位注射青霉素誘發(fā)癲癇模型的建立

        將大鼠以烏拉坦(1.25 g/kg)腹腔注射麻醉,固定于腦立體定位儀上,以前囟為零點,用牙科鉆在前囟向后2 mm,右旁開2 mm處行顱骨鉆孔,暴露出直徑為0.2-0.3 cm的硬腦膜,放置銀球懸浮記錄電極。采用RM6240C型多道生物信號采集處理系統(tǒng)記錄腦皮層電圖(EcoG)。待動物清醒后(術(shù)后約4-5 h),在前囟向后1 mm,左旁開1 mm,顱骨下1 mm處注射青霉素200 U,出現(xiàn)癇性發(fā)作并記錄到典型的棘波、尖波、棘慢波等癇性波,則模型建立成功。

        1.3 動物分組及給藥

        將144只大鼠隨機分為4組,每組36只。正常對照組:皮層注射生理鹽水2μl,30 min后腹腔注射生理鹽水2 ml,10 min后腹腔注射生理鹽水1 ml;癲癇模型組:皮層注射青霉素200 U,30 min后腹腔注射生理鹽水2 ml,10 min后腹腔注射生理鹽水1 ml;荷包牡丹堿+高牛磺酸處理組:皮層注射青霉素200 U,30 min后腹腔注射GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿7.5 mg/kg和GABAB受體阻斷劑高?;撬?5 mg/kg,10 min后腹腔注射生理鹽水1 ml;荷包牡丹堿+高?;撬?蠅蕈醇處理組:皮層注射青霉素200 U,30 min后腹腔注射荷包牡丹堿7.5 mg/kg和高?;撬?5 mg/kg,10 min 后腹腔注射蠅蕈醇 1.0 mg/kg。

        1.4 觀察指標

        行為指標:參照Racine癇性行為分級標準[11],0級:無反應(yīng)或抽搐停止;Ⅰ級:節(jié)律性嘴或面部抽動;Ⅱ級:點頭或甩尾;Ⅲ級:單肢抽動;Ⅳ級:多肢抽動或強直;Ⅴ級:全面性強直-陣攣發(fā)作。以出現(xiàn)Ⅰ-Ⅲ級為部分性發(fā)作,Ⅳ-Ⅴ級為全面性發(fā)作。癲癇發(fā)作持續(xù)時間:以注射青霉素后出現(xiàn)癇樣放電到癇樣放電消失所需的時間為癲癇發(fā)作持續(xù)時間,各組隨機抽取6只大鼠記錄癲癇發(fā)作持續(xù)時間。

        腦電指標:EcoG記錄參數(shù)如下:采集頻率1 000 Hz;掃描速度800 ms/div;靈敏度,1 mV;時間常數(shù),0.4 s;濾波頻率10 Hz;低通濾波15 Hz。記錄各組大鼠ECoG癇樣放電,以各組大鼠發(fā)作高峰時段的腦電計算癇樣波頻率、振幅的平均值作為該大鼠癇樣放電指標,以注射青霉素后出現(xiàn)癇樣放電到癇樣放電消失所需的時間為癲癇樣放電持續(xù)時間,各組隨機抽取6只大鼠腦電作統(tǒng)計學(xué)分析。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

        2 結(jié)果

        2.1 激動GABAC受體對癇性行為和發(fā)作持續(xù)時間的影響

        表1顯示,癲癇模型組36只大鼠在注入青霉素后均出現(xiàn)Ⅰ-Ⅲ級發(fā)作。給予GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿和GABAB受體阻斷劑高?;撬岷竽苊黠@延長大鼠癲癇發(fā)作的持續(xù)時間,36只動物中有約88.9%的動物發(fā)作級別增加,出現(xiàn)Ⅳ-Ⅴ級發(fā)作,與癲癇模型組比較,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);與荷包牡丹堿+高?;撬崽幚斫M比較,給予蠅蕈醇激動GABAC受體能顯著縮短大鼠癲癇發(fā)作的持續(xù)時間,降低發(fā)作級別,僅有19%的動物出現(xiàn)Ⅳ-Ⅴ級發(fā)作(P<0.05)。

        表1 蠅蕈醇、荷包牡丹堿和高?;撬釋η嗝顾卣T發(fā)大鼠癲癇發(fā)作持續(xù)時間及行為的影響(±s)Table 1 Effects of muscimol,bicuculline and homotaurine on the duration and behavior of penicillin-induced seizures in rats(±s)

        表1 蠅蕈醇、荷包牡丹堿和高?;撬釋η嗝顾卣T發(fā)大鼠癲癇發(fā)作持續(xù)時間及行為的影響(±s)Table 1 Effects of muscimol,bicuculline and homotaurine on the duration and behavior of penicillin-induced seizures in rats(±s)

        與癲癇模型組比較,*P<0.05;與荷包牡丹堿+高牛磺酸處理組比較,#P<0.05;n1=6,n2=36

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        2.2 激動GABAC受體對EcoG癇樣放電持續(xù)時間、癇波頻率及最高振幅的影響

        圖1和表2結(jié)果顯示,癲癇模型組在給予青霉素后,2-5 min內(nèi)開始記錄到棘波、尖波、棘慢波等癇樣波,放電持續(xù)時間為(72.8±6.3)min,發(fā)作高峰期癇樣波頻率為(43.4±5.5)/min,振幅為(3.0±0.6)mV。給予 GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿和GABAB受體阻斷劑高?;撬岷蠓烹姵掷m(xù)時間、癇樣波頻率及振幅均顯著增高(P<0.05)。給予蠅蕈醇激動GABAC受體可顯著抑制GABAA和GABAB受體阻斷劑引起的放電持續(xù)時間延長(P<0.05),并降低相同時間內(nèi)的癇樣波頻率和振幅,分別與癲癇模型組及荷包牡丹堿+高牛磺酸處理組相比,均有顯著性差異(P<0.05)。

        圖1 蠅蕈醇、荷包牡丹堿和高牛磺酸對青霉素誘發(fā)的大鼠癇樣放電的代表性EcoGFigure 1 Representative EcoGrecordings for the effects of muscimol,bicuculline and homotaurine on penicillin-induced epileptic discharges in rats

        表2 蠅蕈醇、荷包牡丹堿和高?;撬釋η嗝顾卣T發(fā)的大鼠癇樣放電的持續(xù)時間、癇波頻率及振幅的影響(±s,n=6)Table 2 Effect of muscimol,bicuculline and homotaurine on duration,frequency and amplitude of penicillin-induced epileptic discharges in rats(±s,n=6)

        表2 蠅蕈醇、荷包牡丹堿和高?;撬釋η嗝顾卣T發(fā)的大鼠癇樣放電的持續(xù)時間、癇波頻率及振幅的影響(±s,n=6)Table 2 Effect of muscimol,bicuculline and homotaurine on duration,frequency and amplitude of penicillin-induced epileptic discharges in rats(±s,n=6)

        與癲癇模型組比較,*P<0.05;與荷包牡丹堿+高?;撬崽幚斫M比較,#P<0.05

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        3 討論

        青霉素是經(jīng)典的致癇劑,其通過拮抗GABAA受體,引起抑制性突觸活動減弱或興奮性突觸活動增強,從而導(dǎo)致神經(jīng)元興奮性增高[10,12]。本實驗中,通過在大鼠大腦皮層一側(cè)運動區(qū)注射青霉素,成功制備了簡單部分性發(fā)作模型,表現(xiàn)為點頭、甩尾、單肢抽動(Ⅰ-Ⅲ級),EcoG出現(xiàn)明顯的癇性放電,特征為頻發(fā)的棘波和棘慢綜合波。

        研究表明,GABAA受體位于中樞突觸后膜,GABA結(jié)合該受體打開氯離子通道產(chǎn)生抑制性突觸后電位進而抑制神經(jīng)元放電,其介導(dǎo)了CNS大多數(shù)的快速抑制效應(yīng),而GABAB受體則通過與G蛋白偶聯(lián)介導(dǎo)了慢的抑制效應(yīng),二者均參與了內(nèi)源性的抗癲癇機制[13]。本實驗在大鼠運動皮層定位注射青霉素誘發(fā)癲癇發(fā)作模型中發(fā)現(xiàn),利用荷包牡丹堿和高?;撬嶙钄郍ABAA和GABAB受體可使青霉素誘發(fā)癇性活動進一步增強,大部分大鼠出現(xiàn)陣攣發(fā)作,發(fā)作程度加重至Ⅳ-Ⅴ級,同時棘波頻率增快、振幅增大、發(fā)作持續(xù)時間延長了近1倍。這一結(jié)果表明,阻斷GABAA和GABAB受體使得 CNS失去了由GABAA和GABAB受體介導(dǎo)的大多數(shù)抑制效應(yīng)。由于GABAC受體對前面兩種阻斷劑不敏感[9],由它所介導(dǎo)的抑制作用并不受影響。

        研究發(fā)現(xiàn),GABAC受體介導(dǎo)的抑制作用可發(fā)生在突觸間隙低濃度的GABA作用下,而GABAA受體的激活需要高濃度的 GABA刺激,同時,與GABAA受體快激活快失活的特性不同,GABAC受體介導(dǎo)的抑制作用持續(xù)時程較長,且不表現(xiàn)明顯的脫敏作用[8]。因此,當突觸間隙GABA的濃度降低到一定值時,GABAA受體已無法承擔所應(yīng)維持的抑制強度,此時,GABAC受體介導(dǎo)的抑制作用便顯得必不可少。這些特殊的生理特性也意味著它所介導(dǎo)的抑制作用在CNS功能的調(diào)節(jié)中起著重要的作用[14],但它具體是否參與調(diào)節(jié)癲癇的發(fā)作和終止尚不明確。在內(nèi)源性抗癲癇機制研究中蠅蕈醇已被廣泛的作為工具用藥使用。傳統(tǒng)上認為蠅蕈醇為GABAA受體的選擇性激動劑,但在GABA受體蛋白的研究中發(fā)現(xiàn),蠅蕈堿同樣具有激活GABAC受體的活性[15]。GABAC受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),因此,蠅蕈醇激動GABAC受體可改變大腦皮質(zhì),海馬和小腦等多個腦區(qū)的神經(jīng)活動。本實驗在阻滯GABAA和GABAB受體的實驗條件下,以蠅蕈醇作為工具藥激動GABAC受體后,不但能對抗青霉素和GABAA及GABAB受體阻斷劑協(xié)同誘發(fā)的癲癇發(fā)作行為活動,同時可明顯抑制異常腦電活動,表現(xiàn)在顯著縮短發(fā)作持續(xù)時間、減少癇波發(fā)放頻率、降低癲癇波波幅,這一結(jié)果提示,GABAC受體激活能有效抑制癲癇樣放電,終止癲癇發(fā)作,是內(nèi)源性的抗癲癇機制之一,而該受體的抗癲癇作用可能與其生理特性密不可分。我們推測,癲癇發(fā)作時,當GABAA和GABAB受體無法響應(yīng)其速效抑制作用或無法承擔所應(yīng)維持的抑制強度時,GABAC受體即啟動緩慢而持久的抑制效應(yīng),從而自行終止癲癇發(fā)作,機體的內(nèi)源性抗癲癇系統(tǒng)中可能存在“雙重保險”機制。

        綜上所述,本研究首次證實了GABAC受體的激活是內(nèi)源性的抗癲癇機制之一,這將為癲癇的治療學(xué)和抗癲癇藥物的藥理學(xué)研究提供新的思路,但該受體所介導(dǎo)的具體抗癲癇機制還有待深入研究。

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