王堯 崔亞洲 周小燕 韓金祥

1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 2011級(jí) 博士研究生 山東 濟(jì)南 250355

2.山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心 國(guó)家衛(wèi)生部醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省罕見病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250062

軟骨發(fā)育不全（achondroplasia,ACH,MIM:100800），又稱為胎兒型軟骨營(yíng)養(yǎng)障礙（chondrodystrophia fetalis），或稱軟骨營(yíng)養(yǎng)障礙性侏儒（chondrodystrophic dwarfism），是一種常染色體顯性遺傳病，外顯率為100%。這種疾病是由于軟骨內(nèi)成骨缺陷而膜性化骨正常造成的，國(guó)內(nèi)外都非常罕見，據(jù)國(guó)外研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，全球發(fā)病率大概為1/77000～1/15000[1]。在這些患者中80%～90%的新生兒為散發(fā)病例，由基因突變產(chǎn)生，10%～20%則是家系遺傳導(dǎo)致。軟骨發(fā)育不全患者的臨床表現(xiàn)具有共同的特征[2-4]：四肢短小，頭大、前額突出、塌鼻梁，肘關(guān)節(jié)不能伸直，雙腿呈“O”型，伴有鴨步，隨著年齡增長(zhǎng)變得越來越明顯；軀干部位發(fā)育正常，肋骨短，胸骨短而寬，空廓扁平，一般智力及其體力發(fā)育正常，并且性功能良好；手指方面短而粗大，呈現(xiàn)“三叉戟”狀態(tài)，大拇指一組，食指跟中指為一組，無名指與小拇指為一組；脊柱主要表現(xiàn)為胸腰段后凸和椎管狹窄畸形。

成纖維生長(zhǎng)因子受體3（fibroblast growth factor receptor 3,FGFR3）是一種發(fā)育調(diào)節(jié)的單次跨膜受體，參與和調(diào)控軟骨和長(zhǎng)骨發(fā)育的多個(gè)階段，如軟骨細(xì)胞的增生及軟骨基質(zhì)的鈣化，是目前世界公認(rèn)引起軟骨發(fā)育不全的最主要的致病基因，其熱點(diǎn)區(qū)域位于第10外顯子。97%以上突變位點(diǎn)又集中在1138位核苷酸，其中95%為G＞A的堿基轉(zhuǎn)換，其余為G＞C的顛換。兩種突變都導(dǎo)致FGFR3第380位甘氨酸由精氨酸取代(G380R)，從而引起FGFR3蛋白功能表達(dá)異常，影響了軟骨細(xì)胞的增生和鈣化，使軟骨發(fā)育生長(zhǎng)受到阻礙停滯從而導(dǎo)致軟骨發(fā)育不全疾病的產(chǎn)生[5-9]。本研究主要通過毛細(xì)管測(cè)序方法對(duì)軟骨發(fā)育不全患者進(jìn)行基因篩查，以確定患者是否為軟骨發(fā)育不全。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 本實(shí)驗(yàn)中以9例初步診斷為軟骨發(fā)育不全的患者及其他們的父母為研究對(duì)象，共27人。其中9例患者的年齡大多在2～5歲，身高大約在60～80cm，臨床癥狀較為典型，例如四肢短小，頭大、前額突出、塌鼻梁，肘關(guān)節(jié)不能伸直，雙腿呈“O”型，并且具有典型的“三叉手”。患者的父母均為正常人，沒有發(fā)病癥狀。上述參與實(shí)驗(yàn)的人員均獲得并簽署了知情同意書，提供自己的DNA為研究樣本。

1.2 研究方法

1.2.1 血液DNA提?。何覀兂槿∩鲜龌颊呒捌涓改傅耐庵莒o脈血液2～3ml（EDTA抗凝混勻），采用OMEGA公司Blood DNA Midi Kit從血液中提取DNA，用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行檢測(cè)，A260/A280約為1.82。

1.2.2 引物序列設(shè)計(jì)：本實(shí)驗(yàn)依據(jù)NCBI提供的FGFR3基因序列，使用primer premier 5.0設(shè)計(jì)外顯子10的PCR擴(kuò)增所需要的引物，引物序列及退火溫度如表1所示

1.2.3 PCR擴(kuò)增：本實(shí)驗(yàn)使用的PCR擴(kuò)增試劑盒是TAKALA公司的PCR Amplification Kit。每個(gè)反應(yīng)的總體積為25μl，其中反應(yīng)體系內(nèi)包括DNA模板50～200 ng，上游引物與下游引物各1μmol/L，dNTP各200μmol/L，MgCl2 1.5 mmol/L，10×PCR緩沖液2.5μl，Taq DNA聚合酶1U，其余用水補(bǔ)齊。熱循環(huán)儀使用的是PTC-200常規(guī)PCR儀，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)35個(gè)周期，最后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物放入1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳跑膠，觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。擴(kuò)增片段大小為341bp。電泳結(jié)果如圖1所示。

圖1 9例軟骨發(fā)育不全患者PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2 上述序列為反向引物測(cè)序峰圖。箭頭所示位點(diǎn)為患者FGFR3外顯子10的c.1138位點(diǎn)G＞A。

圖3 上述序列為反向引物測(cè)序峰圖。箭頭所示位點(diǎn)為患者FGFR3外顯子10的c.1138位點(diǎn)G＞A。

圖4 上述序列為反向引物測(cè)序峰圖。箭頭所示位點(diǎn)為正常家屬FGFR3外顯子10的c.1138位點(diǎn)。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化及其測(cè)序：將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物用純化試劑盒進(jìn)行純化，去除產(chǎn)物中的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物及其引物二聚體等雜質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)使用的試劑盒是QIAGEN公司QIAquick PCR Purification Kit。將純化好的產(chǎn)物送去華大基因測(cè)序部，使用ABI公司的3730XL測(cè)序儀對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

3 結(jié) 果

對(duì)FGFR3外顯子10測(cè)序分析 通過對(duì)9例患者及其父母進(jìn)行FGFR3外顯子10測(cè)序，我們重點(diǎn)分析了1138位點(diǎn)核苷酸及1123位點(diǎn)核苷酸突變情況。其中9例初步診斷為軟骨發(fā)育不全患者的測(cè)序圖譜中，在1138位點(diǎn)處均出現(xiàn)了雜合峰圖（c.1138 G＞A），而1123位點(diǎn)沒有雜合峰圖，表明這些病人確實(shí)是軟骨發(fā)育不全患者。而在患者的父母測(cè)序峰圖中，1138位點(diǎn)核苷酸及1123位點(diǎn)核苷酸均沒有發(fā)現(xiàn)雜合峰圖，表明患者父母均為正常。這結(jié)果提示在中國(guó)的人群中FGFR3外顯子10的1138位點(diǎn)核苷酸突變也是導(dǎo)致軟骨發(fā)育不全疾病產(chǎn)生的原因[10]。在這9對(duì)家庭中，患者都屬于散發(fā)病例，沒有出現(xiàn)家族遺傳性，這與先前文獻(xiàn)報(bào)道的70%～80%軟骨發(fā)育不全患者屬于散發(fā)病例基本一致[11-12]。此外，這些病例中都為c.1138 G＞A，沒有出現(xiàn)c.1138 G＞C，這也與國(guó)外報(bào)道基本一致[11-12]。圖2和圖3是其中兩個(gè)患者的基因測(cè)序峰圖，圖4為其中一個(gè)患者家屬的測(cè)序峰圖。

4 討 論

軟骨發(fā)育不全是一種罕見的常染色體顯性遺傳疾病，外顯率為100%，發(fā)病率為1/77000～1/15000[1]，由基因突變產(chǎn)生。成纖維生長(zhǎng)因子受體3（FGFR3）是引起軟骨發(fā)育不全的最重要的致病基因，其本質(zhì)是酪氨酸激酶受體，由細(xì)胞外糖基化配體結(jié)合區(qū)、疏水跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶催化區(qū)3部分組成[13]。Shiang等[14]1994年通過聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）結(jié)合單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）和限制性內(nèi)切酶酶解的方法對(duì)軟骨發(fā)育不全患者進(jìn)行基因篩查發(fā)現(xiàn)患者FGFR3基因都有突變，而且突變位置都位于FGFR3疏水跨膜區(qū)，提示疏水跨膜區(qū)可能是影響軟骨發(fā)育的熱點(diǎn)區(qū)域。Perez-Custro等[15]進(jìn)一步對(duì)FGFR3基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該基因長(zhǎng)約15Kb，共有19個(gè)外顯子以及18個(gè)內(nèi)含子，其中引起軟骨發(fā)育不全的突變位點(diǎn)在第10號(hào)外顯子上，恰巧此外顯子編碼FGFR3基因的疏水跨膜區(qū)，進(jìn)一步明確該基因突變位點(diǎn)與疏水跨膜區(qū)有密切聯(lián)系。

FGFR3基因主要由兩處堿基位點(diǎn)突變來引起軟骨發(fā)育不全，分別是：c.1138 G＞A和c.1138 G＞C，屬于單堿基突變。這兩種堿基突變的結(jié)果導(dǎo)致編碼的第380位氨基酸由甘氨酸（Gly）轉(zhuǎn)變成精氨酸（Arg），使蛋白質(zhì)功能發(fā)生改變，從而引起軟骨發(fā)育不全。其中97%軟骨發(fā)育不全患者都是由這兩種堿基突變?cè)斐?，又以c.1138 G＞A為主要突變方式，所占比例達(dá)到95%以上。本研究中，我們?cè)?例散發(fā)的軟骨發(fā)育不全患者上檢測(cè)到FGFR3基因第10外顯子G380R突變，結(jié)果支持G380R是ACH最常見的突變這一結(jié)論，并且證明這種高度一致性的突變?cè)谥袊?guó)ACH患者中也存在[10]。9名患者的G380R突變都是由于FGFR3基因1138位核苷酸G＞A轉(zhuǎn)換所致，未檢測(cè)到G＞C顛換，與西方國(guó)家、日本報(bào)道的研究結(jié)果相似[16-17]。除此之外，1995年瑞典和日本的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了第三處堿基突變位點(diǎn)，他們?cè)谝焕l(fā)和一例家系中分別發(fā)現(xiàn)了c.1123 G＞T，導(dǎo)致編碼的第375位氨基酸由甘氨酸（Gly）轉(zhuǎn)變成半胱氨酸（Cys），但此類突變發(fā)生的概率很低，占所有突變比例的1%～2%[18-19]，在本實(shí)驗(yàn)中所有患者及其父母在這個(gè)位點(diǎn)均沒有發(fā)現(xiàn)此類型突變。

本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管測(cè)序方法檢測(cè)患者FGFR3基因突變，這種方法是目前最直接，最有效的檢測(cè)基因突變方法之一。由于引起此疾病的熱點(diǎn)突變都集中在FGFR3的外顯子10中，因而可以通過這種方法對(duì)患者及其疑似患者做基因水平診斷，從而可以準(zhǔn)確的判定患者是否如軟骨發(fā)育不全，加以針對(duì)性救治。除此之外，毛細(xì)管測(cè)序還可以應(yīng)用于產(chǎn)前診斷及胎兒檢查，以判定胎兒是否為軟骨發(fā)育不全患者。在未來，通過對(duì)基因測(cè)序的方式來診斷軟骨發(fā)育不全必定有著較為廣泛的應(yīng)用前景。

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