王素雅，胡丹丹，楊曉亞，鞠興榮

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省糧油品質(zhì)控制與深加工技術(shù)重點實驗室，江蘇南京，210023)

大豆中含蛋白質(zhì)40%左右，是我國人民重要的蛋白質(zhì)來源。但大豆含有胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素和植酸等抗?fàn)I養(yǎng)因子，會影響人體對其營養(yǎng)成分的吸收利用。大豆發(fā)芽不僅能減少胰蛋白酶抑制因子、植酸以及植物凝集素等不利于人體消化吸收的因子，而且水溶性維生素、大豆異黃酮和γ-氨基丁酸等有益成分含量增加，并形成新型風(fēng)味和口感，是營養(yǎng)豐富的健康食品［1］。

硒是人體必需的微量元素，但我國2/3的地區(qū)缺硒［2］，補充富硒食物是解決硒缺乏的重要途徑。通過種子發(fā)芽法將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，具有工藝簡單、操作簡便、生產(chǎn)穩(wěn)定、周期短、產(chǎn)品易于標(biāo)準(zhǔn)化、成本低等優(yōu)點，因此，富硒發(fā)芽產(chǎn)品備受研究者關(guān)注［3－4］。大豆在食品中的應(yīng)用不僅與其營養(yǎng)價值相關(guān)，也與其蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)也密不可分。由于許多大豆加工品利用其凝膠性質(zhì)，因此，凝膠性質(zhì)是大豆蛋白最重要的功能性質(zhì)之一。然而，發(fā)芽對大豆凝膠性質(zhì)有一定的影響［5］，因此，探討富硒發(fā)芽過程對大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響，可為開發(fā)不同形式的富硒大豆產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗原料與藥品

大豆:東北大豆，購自南京原糧市場。

葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯(GDL):江蘇常州康力食品添加劑廠。

Na2SeO3，NaOH，HCl，正己烷，乙醇，NaClO，NaBH4，甘油，異丙醇，苯酚，甘氨酸，丙烯酰胺，N，N'-甲叉雙丙烯酰胺，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，四甲基乙二胺(TEMED)，考馬斯亮藍R250，十二烷基硫酸鈉(SDS)，過硫酸銨，β-巰基乙醇，溴酚藍，以上所用試劑均為分析純(AR)或生化試劑。

硒標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000μg/mL):Sigma公司;標(biāo)準(zhǔn)蛋白(14.4～97.4kDa):Solarbio公司。

1.2 實驗儀器設(shè)備

HG75－3型電熱恒溫兩用箱，南京實驗儀器廠;PHS－25型pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH－6型恒溫水浴鍋，常州市國華電器有限公司;TDL－80－2B型離心分離機，上海安亭科學(xué)儀器廠;FW100型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;AIPHAI-4LDpluo真空冷凍干燥機，德國Marin Chris;Bio-Rad165－8003型電泳儀/電泳槽，美國Bio-Rad公司;TA.XT2i型物性測試儀，英國Stable Micro Systems Ltd;AFS-3100雙道原子熒光分光光度計，北京科創(chuàng)海光儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 富硒大豆籽粒發(fā)芽

挑選成熟飽滿，無蟲蛀，無霉變，無破損的大豆種子，20 g，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%的NaClO溶液浸泡5 min消毒，蒸餾水沖洗后，分別加50 mL 10 mg/L Na2SeO3溶液(富硒)和蒸餾水(對照)，于恒溫(25℃)培養(yǎng)箱中浸泡6 h，將浸泡后的大豆粒置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽，每隔12 h取樣，96 h后停止發(fā)芽。豆芽用蒸餾水沖洗3遍，置于60℃烘箱中烘干，備用。

1.3.2 硒含量測定

采用氫化物發(fā)生原子熒光法測定硒含量(GB5009.93－2010)。

總硒(total selenium，T-Se)含量的測定:稱取0.5 g 大豆粉于消化管中，加 10 mL HNO3、2 mL H2O2，振搖混合均勻，于微波消化儀中消化。消化完全后轉(zhuǎn)入三角瓶中，加幾粒玻璃珠，在電板上繼續(xù)加熱至近干，切不可蒸干，再加5.0 mL 6mol/L HCl，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o色并伴有白煙出現(xiàn)，將6價硒還原成4價硒。冷卻，轉(zhuǎn)移消化液于25 mL容量瓶中定容，用于總硒含量的測定。

大分子有機硒(organic selenium，O-Se)的測定采用持續(xù)透析法［4］。將大豆粉裝入透析袋(截留分子質(zhì)量3 500kDa)，25℃去離子水透析5 d，每隔12 h換1次水，測定透析后袋里樣品硒含量即為有機大分子有機硒的含量。

1.3.3 GDL大豆凝膠的制備

將發(fā)芽大豆加水(料液比1∶6，g∶mL)磨漿，紗布過濾，豆?jié){在不斷攪拌下小火煮沸3～5 min，脫氣。向豆?jié){中加入2.8 g/L GDL并混勻，85℃保溫20 min后，放入冰水中冷卻成型，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 大豆分離蛋白的制備［6］

發(fā)芽大豆→60℃烘干→磨粉→正己烷脫脂→烘干→堿提酸沉法提取→冷凍干燥→SPI

1.3.5 GDL大豆分離蛋白凝膠制備［5］

120 g/L的SPI溶液→90℃水浴加熱15 min→加2.8 g/L GDL→80℃保溫30 min→冷卻→4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 大豆蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的測定

SDS-PAGE法［7］:采用15%的分離膠和5%的濃縮膠，電泳時的電壓200 V，電流100 mA，功率50 W。3～4 h后，待溴酚藍剛剛遷移出凝膠底部時終止電泳，考馬斯亮藍染色2 h，將凝膠置于脫色液中漂洗，每隔2 h換1次脫色液，直至背景清晰為止。

1.3.7 凝膠硬度的測定［5］

用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀測定大豆凝膠與大豆分離蛋白凝膠硬度，主要參數(shù)如下:運行模式texture profile analysis(TPA);測前速度2.0 mm/s;測試速度1.0 mm/s;測后速度3.0 mm/s;穿刺距離10 mm;時間2 s;數(shù)據(jù)采集速率200 pps;圓柱型探頭(P/0.5)。凝膠破碎時受到的最大力作為凝膠硬度指標(biāo)，力越大凝膠硬度越大。

1.3.8 凝膠持水性測定［8］

按1.3.3和1.3.5的方法于10 mL的離心管內(nèi)制備大豆凝膠和大豆分離蛋白凝膠，稱重后(記為m1)于4℃下4 000r/min離心10 min，記錄離心過程中水分損失量(m2)，計算凝膠持水性(WHC)。

2 結(jié)果與討論

2.1 富硒發(fā)芽過程中大豆總硒與有機硒含量的變化

經(jīng)Na2SeO3溶液浸泡后，大豆在發(fā)芽過程中總硒含量與有機硒含量均有所增加。由圖1可知，10 mg/L Na2SeO3溶液浸泡6 h后，大豆中總硒含量為1.25 μg/g。發(fā)芽 12 h 后，總硒含量增至 3.48 μg/g，至發(fā)芽48 h時總硒含量趨于穩(wěn)定，發(fā)芽96 h時總硒含量為4.60 μg/g，是未發(fā)芽大豆的3.68倍。分析認(rèn)為Na2SeO3在大豆發(fā)芽過程中隨水分子不斷向大豆內(nèi)部滲透，促使發(fā)芽大豆總硒含量升高。大豆中大分子有機硒含量和有機硒轉(zhuǎn)化率在發(fā)芽過程中也呈不斷上升趨勢，發(fā)芽12 h時有機硒含量為0.51 μg/g，有機硒轉(zhuǎn)化率14.57%;發(fā)芽至96 h時，有機硒含量增至 2.05 μg/g，轉(zhuǎn)化率達 44.50%。Sathe［9］等人利用同位素示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)，富硒大豆中89%的硒與蛋白質(zhì)結(jié)合，其中大豆分離蛋白占60%。因此，發(fā)芽時大豆有機硒含量及有機硒轉(zhuǎn)化率增加是Se與蛋白質(zhì)結(jié)合并以硒蛋白形式存在的結(jié)果。

2.2 富硒發(fā)芽過程中大豆蛋白分子質(zhì)量的變化

大豆蛋白根據(jù)沉降系數(shù)的不同分為2S，7S，11S和15S球蛋白。其中主要由7S和11S球蛋白組成，分別占大豆分離蛋白的30%和40%［10］。7S球蛋白主要成分是 β-大豆伴球蛋白(β-conglycinin)［11］，由α’(MW～72 kDa)，α(MW～68 kDa)和 β(MW～52 kDa)3個亞基組成，各亞基之間幾乎無二硫鍵［12］。11S球蛋白的主要成分是大豆球蛋白(glycinin)，由6個亞基對經(jīng)非共價鍵連接而成，每一對亞基由1個酸性亞基(MW～32 kDa)和1個堿性亞基(MW～20 kDa)通過1個二硫鍵相連［13］。11S大豆球蛋白有5種亞基。各亞基的分子質(zhì)量約為:A3～37 kDa，A1，A2，A4～34 kDa，B3～23 kDa，B1，B2，B4～22 kDa［14］。

實驗分析了不同發(fā)芽時間富硒大豆SPI的SDSPAGE電泳圖譜，結(jié)果見圖2。圖譜從上到下的區(qū)帶分別是7S球蛋白(α’，α，β)區(qū)帶和11S球蛋白(A3，A1A2A4，B3，B1B2B4)區(qū)帶［12］。由圖2可知，發(fā)芽過程中大豆7S球蛋白的β亞基與11S球蛋白的堿性亞基B含量沒有明顯變化，而7S球蛋白的α’亞基和α亞基與11S球蛋白的酸性A3、A隨著發(fā)芽而逐漸減少。發(fā)芽48 h內(nèi)，這4種亞基快速減少，說明它們是大豆內(nèi)源蛋白酶的主要作用對象，被降解為相對分子質(zhì)量較小的組分。在相同發(fā)芽條件下，富硒大豆與對照大豆的蛋白譜帶基本一致，說明富硒處理并未影響蛋白質(zhì)的代謝途徑，該結(jié)果與吳永堯［15］在富硒水稻和趙鐳［16］在富硒靈芝的研究結(jié)果一致，硒進入蛋白質(zhì)代謝但并不改變蛋白質(zhì)原來的合成代謝途徑。

圖2 發(fā)芽大豆分離蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE profile of SPI during soybean germination

2.3 富硒發(fā)芽過程中大豆凝膠硬度的變化

蛋白質(zhì)凝膠形成的機理非常復(fù)雜，參與形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的作用力包括疏水作用、二硫鍵、氫鍵和靜電相互作用［17］。蛋白質(zhì)分子受熱變性后，原包埋于卷曲結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水基團暴露出來，同時，高溫使蛋白質(zhì)分子熱運動加劇，分子間相互碰撞的機率增大，因而有助于分子間通過疏水相互作用形成交聯(lián)。而且蛋白質(zhì)變性后暴露出極性的—CO和—NH，使多肽鏈附近形成水化層，有利于形成氫鍵。此外，加熱還會引起—SH和—S—S—的交換反應(yīng)，形成分子間或分子內(nèi)的二硫鍵合，這些相互作用和二硫鍵合導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝膠的形成［18］。

以葡萄糖酸內(nèi)酯(GDL)為凝固劑，富硒發(fā)芽大豆GDL凝膠硬度隨發(fā)芽時間的變化見圖3。由圖3可知，在發(fā)芽過程中大豆GDL凝膠硬度逐漸降低，特別是在發(fā)芽48 h內(nèi)，大豆GDL凝膠硬度由25.25g快速降低至10.77g，降低了57.35%。蛋白質(zhì)是形成大豆凝膠的主體，因此分析了富硒發(fā)芽大豆分離蛋白(SPI)的凝膠硬度隨發(fā)芽時間的變化。由圖4可知，在發(fā)芽12 h至60 h，發(fā)芽大豆SPI的凝膠強度快速下降。發(fā)芽48 h時富硒大豆分離分離蛋白GDL凝膠硬度由27.73g降至13.37g，降低了51.79%，與發(fā)芽大豆GDL凝膠硬度的變化趨勢一致。根據(jù)發(fā)芽大豆蛋白質(zhì)電泳圖譜可知，此時7S球蛋白的α’亞基和α亞基與11S球蛋白的酸性亞基A3、A降解速度較快，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚合度降低，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變疏松，從而造成大豆蛋白凝膠硬度降低，說明這些蛋白亞基對大豆蛋白凝膠形成具有重要的作用［19］。由圖3，圖4還可看出，發(fā)芽過程中富硒大豆的凝膠硬度均略高于對照。硒酸鹽被植物吸收后，按照硫的代謝途徑被進一步同化［20］，因此硒在植物體內(nèi)主要是以硒代半胱氨酸(Se-Cys)的形式存在［4］。大豆蛋白質(zhì)分子在受熱變性后，Cys殘基之間形成分子內(nèi)或分子間的S-S是大豆凝膠形成的原因之一，富硒大豆蛋白中的Se-Cys形成分子內(nèi)或分子間的Se-Se鍵，根據(jù)Shchedrina［20］，用來還原 S-S 的二硫蘇糖醇(DTT)無法還原Se-Se，只有非常強的還原劑才能還原Se-Se，因此Se-Se的解離能要高于S-S，解離能高，化學(xué)鍵強度大，分子本身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這可能是富硒發(fā)芽大豆的凝膠硬度略高于對照的原因。

圖3 發(fā)芽過程中大豆凝膠硬度的變化Fig.3 Changes of soybean gel hardness during germination

圖4 發(fā)芽過程中SPI凝膠硬度的變化Fig.4 Changes of SPI gel hardness during soybean germination

2.4 富硒發(fā)芽過程中大豆凝膠持水性的變化

持水性體現(xiàn)了豆腐凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密性，是豆腐重要特性之一。富硒發(fā)芽大豆及其分離蛋白GDL凝膠的持水性見圖5和圖6。由圖5可知，未發(fā)芽的富硒大豆GDL凝膠持水性為61.42%，而隨著發(fā)芽時間的延長，發(fā)芽大豆凝膠的持水性幾乎呈線性降低，至發(fā)芽96 h時，富硒發(fā)芽大豆凝膠的持水性降至40.34%，降低了34.32%。由圖6可知，未發(fā)芽富硒大豆SPI凝膠的持水性為62.64%，在發(fā)芽60 h內(nèi)SPI凝膠的持水性持續(xù)降低，發(fā)芽60 h時凝膠持水性為50.95%，該結(jié)果與大豆凝膠持水性的變化趨勢一致。根據(jù)電泳圖譜可知，大豆7S球蛋白的α’亞基和α亞基與11S球蛋白的酸性亞基A3和A亞基因發(fā)芽而逐漸降解，對蛋白凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)造成破壞，在豆腐凝膠結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生較大空洞，因此持水性下降［19］。從圖5，圖6還可看出，發(fā)芽過程中富硒發(fā)芽大豆的凝膠持水性均略高于對照，原因與富硒大豆凝膠的網(wǎng)絡(luò)強度高于對照，能更好地將水分鎖在凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)有關(guān)。

圖5 發(fā)芽過程中大豆凝膠持水性的變化Fig.5 Changes of WHC of soybean gel during germination

圖6 發(fā)芽過程中大豆分離蛋白凝膠持水性的變化Fig.6 Changes of WHC of SPI gel during soybean germination

3 結(jié)論

經(jīng)Na2SeO3溶液浸泡6 h后，在發(fā)芽的96 h內(nèi)，總硒含量、有機硒的含量及有機硒轉(zhuǎn)化率均隨發(fā)芽時間的延長而增加。發(fā)芽96 h時大豆總硒含量為4.60 μg/g，有機硒含量增至2.05μg/g，轉(zhuǎn)化率達44.50%，說明大豆發(fā)芽過程具有較強的硒生物轉(zhuǎn)化能力。富硒大豆和SPI的GLD凝膠硬度與持水性均隨發(fā)芽時間的延長而降低。在發(fā)芽48 h內(nèi)，大豆GLD凝膠硬度從25.25g迅速降至10.77g，持水性由61.42%降至51.55%，SPI凝膠硬度從27.73g降至13.37g，持水性由62.64%降至55.54%。富硒大豆SPI的凝膠硬度及持水性均較對照略高，但兩者沒有明顯差異，說明富硒對發(fā)芽大豆凝膠性質(zhì)影響有限。根據(jù)發(fā)芽過程中大豆凝膠性質(zhì)的變化規(guī)律，可將發(fā)芽48 h內(nèi)的富硒大豆用于開發(fā)富硒豆腐類產(chǎn)品，將發(fā)芽48 h以后的大豆用于開發(fā)豆腦、豆?jié){等產(chǎn)品。

SDS-PAGE圖譜顯示，富硒大豆的蛋白譜帶與對照組基本一致，說明富硒沒有顯著改變蛋白質(zhì)的代謝。在發(fā)芽過程中，大豆7S球蛋白的α'亞基和α亞基與11S球蛋白的酸性亞基A3亞基和A亞基隨發(fā)芽時間的延長而被逐漸降解為相對分子質(zhì)量較小的組成，從而影響發(fā)芽大豆凝膠性質(zhì)，而富硒對大豆蛋白質(zhì)凝膠性質(zhì)的影響較小。

［1］郭令鳥，霍貴成.發(fā)芽大豆生化特性及其營養(yǎng)變化［J］.糧油食品科技，2002，10(4):8－10.

［2］孫長顥，凌文華，黃國偉，等.營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)(第七版)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012

［3］馬艷弘，周劍忠，王英，等.富硒發(fā)芽大豆乳飲料的研制及穩(wěn)定性研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(3):390－392.

［4］張紅.大豆發(fā)芽富硒工藝及硒在豆芽中的分布研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［5］王素雅，趙甲慧，鞠興榮，等.發(fā)芽對大豆蛋白凝膠性質(zhì)的影響［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(10):62－66.

［6］陳莉，鐘芳，王璋.凝固劑及凝固條件對大豆蛋白膠凝性質(zhì)的影響［J］. 中國乳品工業(yè)，2004，32(9):23－27.

［7］高麗，張聲華.大豆蛋白凝膠前后SDS-PAGE圖譜比較分析［J］. 糧油食品科技，2009，17(3):25－27.

［8］Gu X，Campbell L J，Euston S R.Influence of sugars on the characteristics of glucono-δ-lactone-induced soy protein isolate gels［J］.Food Hydrocolloids，2009，23(2):314 －326.

［9］Sathe S K，Mason A C，Rodibaugh R，et al.Chemical Form of Selenium in Soybean(Glycine max L.)Lectin［J］.Agricultural and Food Chemistry，1992，40(11):2 084 － 2 091.

［10］Mujoo R，Trinh D T，Ng P K W.Characterization of storage proteins in different soybean varieties and their relationship to tofu yield and texture［J］.Food Chemisty，2003，82:265 －273.

［11］王麗，張英華.大豆分離蛋白的凝膠性及其應(yīng)用的研究進展［J］. 中國糧油學(xué)報，2010，25(4):96－99.

［12］Mori T，Utsumi S，Inaba H，et al.Differences in subunit composition of glycinin among soybean cultivars［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1981，29(1):20－23.

［13］田琨，管娟，邵正中，等.大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)與性能［J］. 化學(xué)進展，2008，20(4):565 －573.

［14］Zarkadas C G，Gagnon C，Poysa V，et al.Protein quality and identification of the storage protein subunits of tofu and null soybean genotypes，using amino acid analysis，one and two-dimensional gel electrophoresis，and tandem mass spectrometry［J］.Food Research International，2007，40(1):111－128.

［15］吳永堯.水稻積累硒的生理生化特性及其含硒蛋白研究［D］.長沙:湖南師范大學(xué)，1998.

［16］趙鐳.靈芝生物富硒及富硒靈芝硒蛋白的分離純化和抗氧化性研究［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［17］Shimada K，Matsushita S.Effect of salts and denaturants on thermocoagulation of proteins［J］.Agricultural and Food Chemistry，1981，29(1):15 －20.

［18］鐘芳，王璋，許時嬰.大豆蛋白速凝特性研究［J］.中國糧油學(xué)報，2001，16(4):47 －50.

［19］Poysa V，Woodrow L，Yu K.Effect of soy protein subunit composition on tofu quality ［J］.Food Research International，2006，39(3):309 －317.

［20］Shchedrina V A，Novoselov S V，Malinouski M Y，et al.I-dentification and characterization of a selenoprotein family containing a diselenide bond in a redox motif［J］，PNAS，2007，104(35):13 919 －13 924.