胡向東，潘玲燕，章祺，葉茂，梁新樂

1(浙江皇冠科技有限公司，浙江 杭州，310012)

2(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江杭州，310018)

蝦青素(astaxanthin)為 3，3-二羥基-4，4-二酮基-β，β-胡蘿卜素，是一種酮式類胡蘿卜素，為艷麗紅色，具脂溶性，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖，可使水產(chǎn)動物呈現(xiàn)鮮艷的顏色，以更具觀賞性［1］;另外蝦青素具有極強(qiáng)的生物抗氧化性、促進(jìn)機(jī)體抗體產(chǎn)生、增強(qiáng)免疫力以及抗紫外線輻射等作用［2］。因而在食品添加劑、水產(chǎn)養(yǎng)殖、化妝品、保健品和醫(yī)藥工業(yè)方面有廣闊的應(yīng)用前景［3－6］。

紅法夫酵母作為蝦青素的主要生物來源之一，具有能利用多種糖類進(jìn)行異養(yǎng)代謝、生長速度快、培養(yǎng)時間短、不需要光照、能夠在發(fā)酵罐中高密度培養(yǎng)等優(yōu)點［7］。但野生型紅法夫酵母因其蝦青素產(chǎn)量低，每克干酵母僅產(chǎn)生約500 μg類胡蘿卜素，而產(chǎn)蝦青素僅為350 μg，無法滿足市場需求，為提高其蝦青素產(chǎn)量，一個重要的方法是進(jìn)行誘變育種。UV誘變是常用的物理誘變方法，但是單純的紫外誘變效果不理想，因此國內(nèi)外學(xué)者對此進(jìn)行了大量研究，采用UV-亞硝基胍 (NTG)協(xié)同誘變［8］、LiCl-UV和NTG復(fù)合誘變［9］、UV-NTG 和60Co-γ 射線復(fù)合誘變［10］等誘變方法對紅法夫酵母菌株進(jìn)行誘變，提高蝦青素的產(chǎn)量。本文首先對紅法夫酵母菌株進(jìn)行UV-LiCl復(fù)合誘變處理以篩選高產(chǎn)菌株，再對其用60Co-γ射線誘變處理，篩選若干高產(chǎn)菌株后再進(jìn)行一輪UV-LiCl復(fù)合誘變和60Co-γ射線誘變處理，從而選育出高產(chǎn)蝦青素且具有穩(wěn)定性遺傳的酵母菌株，命名為HSC-125。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

親本菌株為紅法夫酵母(P.rhodozyma)02，由浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院保藏，由梁新樂(浙江杭州)贈送，于－80℃下保存于含有30%的甘油內(nèi)。

1.1.2 培養(yǎng)基

YM培養(yǎng)基(g/L):10.0葡萄糖，5.0縮酵母浸出粉，5.0蛋白胨，pH 5.4。若為固體培養(yǎng)基需加入2.5%瓊脂粉。

YM-二苯胺選擇性培養(yǎng)基:待YM培養(yǎng)基冷卻至50℃時加入一定量的無菌二苯胺溶液。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):20.0葡萄糖，5.0蛋白胨，5.0 濃縮酵母浸出粉，3.0(NH4)2SO4，0.5 MgSO4·7H2O，1.5 KH2PO4，0.1 CaCl2·2H2O，pH 5.4。

1.2 培養(yǎng)及分析方法

1.2.1 菌種活化

從－80℃保藏的菌懸液或YM斜面上取1環(huán)至裝有30 mL新鮮YM液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中。22℃、220 r/min培養(yǎng)36～48 h后，稀釋10－6涂布于YM平板，置于22℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。挑取顏色深紅且較大菌落于斜面，置于22℃培養(yǎng)3～5 d。

1.2.2 種子培養(yǎng)

挑取斜面上的活化菌至裝有30 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶，置于22℃、220 r/min的恒溫?fù)u床，培養(yǎng)36～48 h。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

取種子培養(yǎng)液，按10%(v/v)接種量接入裝有30 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于22℃、220 r/min的恒溫?fù)u床，培養(yǎng)72 h。

1.2.4 蝦青素含量的測定

采用紫外分光光度測定法［11］。取5 mL發(fā)酵液于5 000 r/min下離心10 min，去離子水洗滌2次，收集菌體，加入1 mL 55℃預(yù)熱的二甲亞砜 (DMSO)，振蕩懸浮，加入丙酮4 mL，漩渦振蕩20～30 s，最后4℃，5 000 r/min離心10 min，上清液用分光光度計測OD474。如菌泥仍有色可重復(fù)抽提至白色為止，蝦青素含量計算:

式中:A，OD474mm值;V1，有機(jī)溶劑的總體積，mL;2 150，比消光系數(shù);V2，發(fā)酵液體積，mL;100，單位換算后的作數(shù)，mg/L。

1.2.5 菌體生物量的測定

取5 mL菌懸液，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，菌體用去離子水洗2次，在烘箱中于105℃烘至恒重，然后稱重。

1.3 誘變方法

1.3.1 二苯胺抗性濃度的確定

將對數(shù)期的出發(fā)菌株P(guān).rhodozyma 02菌液用無菌生理鹽水稀釋不同梯度濃度:106、105、104、103、102/mL，分別取3 μL菌懸液點樣到含二苯胺(二苯胺濃度分別為 0、10、20、40、60、80、100 μmol/L)的抗性平板。22℃培養(yǎng)5～7 d，觀察不同平板上菌落的生長情況及菌落顏色變化，顏色由紅到淺黃直到無色，即為二苯胺對該菌的最小抑制濃度(MIC)。

1.3.2 UV-LiCl復(fù)合誘變育種

將對數(shù)期的出發(fā)菌株菌液用無菌生理鹽水稀釋到106/mL，然后各取5 mL菌懸液于帶磁力轉(zhuǎn)子的培養(yǎng)皿中，各加入300 μL 10%LiCl混勻后開蓋進(jìn)行紫外線照射。在30 cm，15 W 下紫外線光照1、3、5、7、9、12、15、20 min。將經(jīng)過不同時間照射后的菌液黑暗處理稀釋10－3倍，涂布于已確定的二苯胺最適濃度平板上，在22℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)5～7 d。以未經(jīng)誘變的菌懸液同樣操作作為對照，計算致死率。從平板上篩選顏色較紅，菌落較大的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，檢測各菌株生物量和蝦青素產(chǎn)量，篩選較好的菌株進(jìn)行60Co-γ射線誘變育種。

1.3.360Co-γ射線誘變育種

將UV-LiCl復(fù)合誘變篩選到的高產(chǎn)菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，菌懸液濃度稀釋至106/mL，進(jìn)行60Co-γ射線處理，照射劑量為 2、3、3.5、4、4.5、5 kGy。輻射處理由浙江省農(nóng)科院輻照中心進(jìn)行。將照射后的菌液稀釋，涂布于二苯胺抗性平板，22℃培養(yǎng)5～7 d。觀察菌落生長情況，同時以未經(jīng)誘變的菌懸液同樣操作作為對照，計算致死率。從平板上篩選顏色較紅，菌落較大的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，檢測各菌株生物量和蝦青素產(chǎn)量，篩選蝦青素高產(chǎn)菌株。

1.3.4 第二輪復(fù)合誘變

篩選出經(jīng)60Co-γ射線誘變后高產(chǎn)蝦青素的菌株，在最佳紫外光照射時間和最佳60Co-γ射線誘變劑量下進(jìn)行下一輪復(fù)合誘變，其余步驟同“1.3.2和1.3.3”。

1.4 菌株穩(wěn)定性測試

篩選出經(jīng)兩輪UV-LiCl誘變和60Co-γ射線誘變育種后的高產(chǎn)蝦青素菌株，對其進(jìn)行穩(wěn)定性試驗，傳代5次，分別測定其生物量和蝦青素產(chǎn)量，驗證菌株遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 二苯胺篩選劑量的選擇

在進(jìn)行誘變育種前，將不同濃度的抗性篩選劑二苯胺添加到Y(jié)M固體培養(yǎng)基內(nèi)，誘變后，當(dāng)抑制劑去除，突變型菌株所合成的蝦青素含量往往比野生型高，利用這一原理篩選出蝦青素含量較高的突變株。如圖1，出發(fā)菌株P(guān).rhodozyma 02隨著二苯胺濃度的增加顏色逐漸變淡，出發(fā)菌株在40 μmol/L的抗性平板上顏色發(fā)白，達(dá)到了通過顏色即可區(qū)分高低產(chǎn)菌株的效果，因此本實驗選擇MIC為40 μmol/L做為抑制劑的篩選濃度。

圖1 紅法夫酵母菌株在不同濃度二苯胺平板上的生長情況Fig.1 Growth of P.rhodozyma 02 strains on YM agar medium with different concentrations of diphenylamine

2.2 UV-LiCl復(fù)合誘變育種結(jié)果

2.2.1 UV-LiCl復(fù)合誘變劑量的確定

LiCl是一種堿金屬鹵化劑，本身并無誘變作用，但與紫外線復(fù)合，克服了單純用紫外線誘變效果不理想的弊端，且在一定濃度范圍內(nèi)，有利于菌體正突變的發(fā)生［12］。因此，本實驗將原始紅法夫酵母菌株進(jìn)行UV-LiCl協(xié)同誘變，稀釋后涂布于含有40 μmol/L二苯胺的YM平板上培養(yǎng)后，計算得到的致死率和正突變率如圖2。隨著照射時間的延長，紅法夫酵母致死率增大，當(dāng)照射20 min時，紅法夫酵母幾乎完全致死。按照誘變劑量選擇的一般原則，選取菌體致死率大約在80%～95%之間的誘變劑量進(jìn)行誘變［13］，位于此區(qū)間的誘變時間是5～12 min。而當(dāng)誘變時間為7 min時，正突變率達(dá)到最大，為25.64%。因此，本實驗選定紫外線照射時間7 min作為紅法夫酵母菌株UV-LiCl協(xié)同誘變的誘變劑量。

圖2 不同劑量UV-LiCl處理對紅法夫酵母菌株的影響Fig.2 Dose response curves of P.rhodozyma 02 strains by UV-LiCl radiation

2.2.2 UV-LiCl復(fù)合誘變高產(chǎn)菌株的篩選

P.rhodozyma 02菌株經(jīng)紫外照射7 min后，平板初篩63個單菌落，選取其中菌落大、顏色亮而紅的菌株12株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測定蝦青素含量和生物量。結(jié)果見表1。從表1中可以看出，突變株H1－2、H1－12蝦青素體積產(chǎn)量較高，分別是(9.62±0.16)mg/L和(9.44±0.14)mg/L，分別是出發(fā)菌株 P.rhodozyma 02的2.02和1.99倍。因此將H1－2、H1－12作為下一步60Co-γ射線誘變的出發(fā)菌株。

2.3 60Co-γ射線誘變育種結(jié)果

2.3.160Co-γ射線復(fù)合誘變劑量的確定

從UV-LiCl誘變結(jié)果中得到H1－2、H1－12兩株蝦青素產(chǎn)量較高的突變株，分別取其對數(shù)期菌懸液，稀釋成濃度為106/mL，將其混合后進(jìn)行不同劑量的60Co-γ射線照射，平板培養(yǎng)后計算得到致死率和正突變率。如圖3，隨著誘變劑量的增加，紅法夫酵母致死率增大，紅法夫酵母正突變率先增大后降低。當(dāng)誘變劑量為3.5 kGy時，致死率為84.95%，正突變率達(dá)到最大為32.4%，當(dāng)誘變劑量高于3.5 kGy時，致死率達(dá)到90%左右，正突變率低于24.36%;當(dāng)誘變劑量低于3.5 kGy時，致死率低于80%正突變率低于20.86%。因此選擇3.5 kGy為最適誘變劑量。

表1 UV-LiCl復(fù)合誘變突變株的生物量和蝦青素產(chǎn)量Table 1 Biomass and astaxanthin production of mutants by UV-LiCl radiation

圖3 不同劑量60Co-γ射線誘變處理對紅法夫酵母突變株的影響Fig.3 Dose response curves of mutants by60Co-γ radiation

2.3.260Co-γ射線誘變高產(chǎn)菌株的篩選

H1－2、H1－12 突變株經(jīng)3.5 kGy劑量的60Co-γ射線誘變后，平板初篩得到52個單菌落，選取其中菌落大、顏色亮而紅的菌株12株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測定蝦青素含量和生物量。結(jié)果見表2。從表2中可以看出，突變株H2－5和H2－10的蝦青素產(chǎn)量分別是(13.27±0.17)mg/L和(13.75±0.08)mg/L，分別是出發(fā)菌株H1－2的1.38和1.43倍。因此將H2－5和H2－10作為第2輪UV-LiCl復(fù)合誘變的出發(fā)菌株。

表2 60Co-γ射線誘變突變株的生物量和蝦青素產(chǎn)量Table 2 Biomass and astaxanthin production of mutants by60Co-γ radiation

2.4 第2輪UV-LiCl復(fù)合誘變育種結(jié)果

將60Co-γ射線誘變育種篩選到的H2－5和H2－10菌株作為第2輪UV-LiCl復(fù)合誘變育種的出發(fā)菌株，UV照射處理時間7 min。平板初篩得到56個單菌落，選取其中菌落大、顏色亮而紅的菌株10株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測定蝦青素含量和生物量。結(jié)果見表3。從表3中可以看出，突變株H3－3和H3－10的蝦青素產(chǎn)量分別是(18.59±0.07)mg/L和(18.40±0.10)mg/L，分別是出發(fā)菌株 H2－10的1.35和1.34倍。因此將突變株H3－3和H3－10作為第2輪60Co-γ射線誘變的出發(fā)菌株。

表3 第2輪UV-LiCl復(fù)合誘變突變株的生物量和蝦青素產(chǎn)量Table 3 Biomass and astaxanthin production of mutants by the second-round UV-LiCl radiation

2.5 第2輪60Co-γ射線誘變育種結(jié)果

將第2輪UV-LiCl復(fù)合誘變育種篩選到的H3－3和H3－10菌株作為第2輪60Co-γ射線誘變育種的出發(fā)菌株，誘變劑量為3.5 kGy。平板初篩得到50個單菌落，選取其中菌落大、顏色亮而紅的菌株10株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測定蝦青素含量和生物量。結(jié)果見表4。從表4看出，突變株H4－2和H4－4的蝦青素產(chǎn)量分別是(25.27±0.08)mg/L和(25.52±0.12)mg/L，分別是出發(fā)菌株H3－3的1.36和1.37倍。

表4 第2輪60Co-γ射線誘變突變株的生物量和蝦青素產(chǎn)量Table 4 Biomass and astaxanthin production of mutants by the second-round60Co-γ radiation

2.6 菌株穩(wěn)定性試驗結(jié)果

將2輪復(fù)合誘變得到的2株蝦青素產(chǎn)量較高的突變株H4－2和H4－4，進(jìn)行搖瓶穩(wěn)定性遺傳試驗，考察菌株傳代穩(wěn)定性，結(jié)果見表5。傳代5次后，發(fā)現(xiàn)菌株H4－4具有良好的穩(wěn)定性，而菌株H4－2穩(wěn)定性較差。其中H4－4菌株蝦青素體積產(chǎn)量達(dá)到25.36 mg/L，是原始出發(fā)菌株 P.rhodozyma 02的5.34倍。而H4－2菌株蝦青素細(xì)胞產(chǎn)量最高達(dá)到25.27 mg/L，最低達(dá)到23.34 mg/L。所以最終得到1株穩(wěn)定的高產(chǎn)蝦青素紅法夫酵母菌株H4－4菌株。

3 討論

傳統(tǒng)的物理誘變劑(紫外誘變、γ射線誘變等)比化學(xué)誘變劑，如NTG、甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)毒性更弱。但是紫外線誘變雖然常見但是正突變率低，誘變菌株不穩(wěn)定容易回復(fù)突變，γ射線易在水中產(chǎn)生氧自由基進(jìn)而導(dǎo)致微生物發(fā)生基因重組，基于這個原因γ射線常用來改良菌株［14］。

本試驗選擇UV-LiCl和60Co-γ兩種物理誘變劑對紅法夫酵母菌株進(jìn)行復(fù)合誘變。UV-LiCl誘變已成功應(yīng)用于紅法夫酵母菌株，提高蝦青素產(chǎn)率［12］。利用60Co-γ射線成功改良菌種的報道也很多［15－16］，其正突變率較高，不易發(fā)生回復(fù)突變，操作簡便。

表5 紅法夫酵母突變株穩(wěn)定性遺傳試驗結(jié)果Table 5 Inheritance stability tests of P.rhodozyma mutants

復(fù)合誘變通常包括3類:1是同一種誘變劑重復(fù)使用;2是兩種或多種誘變劑先后使用;3是兩種或多種誘變劑同時使用［17］。遵循上述原則可以有效提高誘變的效率，還能大幅度減輕工作量。本文采用兩種誘變劑先后使用，進(jìn)行2輪UV-LiCl復(fù)合誘變和2輪60Co-γ誘變，最終誘變得到兩株高產(chǎn)蝦青素的紅法夫酵母菌株H4－2和H4－4。經(jīng)穩(wěn)定性試驗考察，H4－4菌株遺傳穩(wěn)定性良好，蝦青素產(chǎn)量為25.36 mg/L，是原始出發(fā)菌株5.34倍。本實驗將最終得到的H4－4菌株命名為HSC－125，保藏編號為 CGMCC No.2024。

由此可見，對于篩選高產(chǎn)蝦青素紅法夫酵母突變株，采用多輪UV-LiCl和60Co-γ射線復(fù)合誘變結(jié)合二苯胺作為抗性篩選劑展現(xiàn)良好效果，并且高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定性良好。

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