劉俊梅，王宏齡，王金枝，范春艷，吳杰

1(玉米深加工國(guó)家工程研究中心博士后工作站/吉林中糧生化有限公司，吉林長(zhǎng)春，130033)

2(吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春，130012)

3(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春，130118)

色氨酸是人體內(nèi)的必需氨基酸之一，還是血清素的前體，對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝起重要的作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料行業(yè)，其工業(yè)化生產(chǎn)方法越來(lái)越為研究人員所重視［1］。早期的L-色氨酸生產(chǎn)方法主要依靠化學(xué)合成和蛋白質(zhì)水解，但這些方法由于材料來(lái)源有限、周期長(zhǎng)、工藝復(fù)雜、雜質(zhì)多等缺點(diǎn)在20世紀(jì)90年代逐漸被淘汰，隨著對(duì)微生物法生產(chǎn)色氨酸的研究深入及基因工程的介入，微生物法已成為目前L-色氨酸生產(chǎn)的主要方法［2－5］。目前，國(guó)內(nèi)L-色氨酸生產(chǎn)工藝研究開(kāi)展較晚，產(chǎn)率較低，限制了工業(yè)化生產(chǎn)［6］。本文采用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌HYH3-1工程菌為研究材料，在合作單位研究的基礎(chǔ)上對(duì)L-色氨酸發(fā)酵的一些關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，并采用10 L發(fā)酵罐進(jìn)行中試放大研究，確定通氣量對(duì)谷氨酸棒桿菌HYH3-1 10 L生物反應(yīng)器分批發(fā)酵的影響。

生物反應(yīng)器分批發(fā)酵的重要目標(biāo)是提高體積產(chǎn)率，即在給定的體積和最短的時(shí)間內(nèi)得到最大的菌體量［7－9］。高密度培養(yǎng)是提高體積產(chǎn)率最有前途的方法之一，指應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)或裝置提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高特定產(chǎn)物的比生長(zhǎng)率［10］。補(bǔ)料分批發(fā)酵是根據(jù)菌體生長(zhǎng)和初始培養(yǎng)條件的控制實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵培養(yǎng)［11－13］。本研究在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上，通過(guò)在10 L生物反應(yīng)器中對(duì)通氣量進(jìn)行優(yōu)化的分批發(fā)酵培養(yǎng)，研究谷氨酸棒桿菌HYH3-1的放大培養(yǎng)規(guī)律，為其大規(guī)模高密度培養(yǎng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

菌株Corynebacterium glutamicum HYH3-1為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的工程菌，斜面保存于4℃冰箱中。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體完全培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母浸出粉5，NaCl 5，葡萄糖1，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，酵母膏15，胰蛋白胨15，NaCl 2.5，脲 1，苯丙氨酸 0.2，酪氨酸 0.2，pH 7.0～7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 60，KH2PO41，K2HPO41，MgSO41，(NH4)2SO420，玉米漿 10，硫酸錳0.01，生物素0.03，CaCO320 ，pH 7.0 －7.2。(葡萄糖溶液采用單獨(dú)高壓滅菌后加入到其他各種成分中)。

以上培養(yǎng)基均于121℃滅菌20 min。

小灶河銅銻礦點(diǎn)，共發(fā)現(xiàn)4條銅銻礦化體，長(zhǎng)約15～280m，寬約2～20m，主要有孔雀石化、輝銅礦化、黃銅礦化、褐鐵礦化，孔雀石呈斑點(diǎn)狀、浸染狀附在巖石裂隙面上，輝銅礦、黃銅礦呈斑點(diǎn)狀集合體賦存在灰?guī)r內(nèi)部，銅的品位在0.2%～3.71%之間，銻的品位在0.1%～1.09%。

1.1.3 主要試劑

苯丙氨酸(色譜純)，Sigma公司;酸酪氨酸(色譜純)，Sigma公司;胰蛋白胨，OXOID公司;酵母浸出粉，OXOID公司，其他國(guó)產(chǎn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Bioflo 110 發(fā)酵罐，New Brunswick Scientific，USA;DHG－9243BS－Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;SHB-A型循環(huán)水式多用真空泵，上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司;HZQF280型臺(tái)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)市華美生化儀器廠;SZ-97型自動(dòng)三重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠;GKC型數(shù)顯控溫水浴鍋，上海浦東電理儀器廠;LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;UV2700型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司;TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;DHP9162型培養(yǎng)箱，上海索普儀器有限公司等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌體活化

從斜面試管中挑取1環(huán)菌種于裝有10 mL種子培養(yǎng)基的試管中，置于22℃的搖床中活化培養(yǎng)，4 d后以10%接種量接入裝液量為100 mL/500 mL種子培養(yǎng)液的三角瓶中，22℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)80 h，備用。

1.3.2 生物量測(cè)定

用移液管吸取10 mL發(fā)酵液于15 000 r/min離心5 min，棄上清液，用去離子水洗滌3次后，置烘箱中，于105℃烘干至恒重，稱(chēng)量。

采用高效液相色譜分析系統(tǒng)測(cè)定，色譜分離條件Agilent Cl8(150 mm × 4.6 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相 V(0.03%，KH2PO4溶液)∶V(甲醇)=90∶10，流速1 mL/min檢測(cè)波長(zhǎng) 278 nm［14］。

1.3.4 葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作

3，5-二硝基水楊酸比色法。1 mL不同濃度的葡萄糖溶液中分別加入2 mL配制好的DNS，沸水浴2 min，取出后用水迅速冷卻，各加入9 mL的蒸餾水。于可見(jiàn)分光光度計(jì)中讀取540 nm下的OD值。

1.3.5 殘?zhí)橇康臏y(cè)定

發(fā)酵液經(jīng)15 000 r/min，離心5 min，取上清液。按照1.3.4方法對(duì)上清液中的葡萄糖含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 10 L生物反應(yīng)器中不同通氣量對(duì)各參數(shù)影響的初步研究

(1)10 L生物反應(yīng)器分批培養(yǎng)方法:種子液以20%的接種量接入經(jīng)滅菌裝有2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的自動(dòng)生物發(fā)酵罐中，發(fā)酵期間主要控制參數(shù)與搖瓶培養(yǎng)確定的最佳參數(shù)相同。

(2)按照(1)生物反應(yīng)器分批培養(yǎng)方法分別進(jìn)行兩組通氣量的發(fā)酵:3.5 m3/h和5.0 m3/h，以對(duì)通氣量進(jìn)行優(yōu)化。

(3)針對(duì)不同通氣量進(jìn)行分批發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸，每隔一段時(shí)間從發(fā)酵罐取樣口中取出一定量的發(fā)酵液，進(jìn)行殘?zhí)橇繚舛?、菌體干重及L-色氨酸產(chǎn)量的測(cè)定，同時(shí)利用發(fā)酵罐的在線(xiàn)檢測(cè)，讀出發(fā)酵液的pH值和OD值，并分別繪制曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

將所得數(shù)值輸入Origin作圖軟件，得到的線(xiàn)性公式和繪制出的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。

圖1 葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of glucose concentration

2.2 不同通氣量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中pH的影響

在轉(zhuǎn)速一定(160 r/min)的條件下，考察兩種不同通氣量對(duì)谷氨酸棒桿菌HYH3-1發(fā)酵過(guò)程中pH的影響(圖2)。

圖2 10 L反應(yīng)器培養(yǎng)中不同通氣量的pH值變化曲線(xiàn)Fig.2 Curve of pH in the 10 L bioreactor of different ventilation capacity

由圖2可見(jiàn)，發(fā)酵液的初始pH基本相同，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中pH變化趨勢(shì)也基本一致。0～24 h發(fā)酵液的pH均下降較快，這可能是由于發(fā)酵初期還原糖含量較多或溶解氧不足，致使糖等物質(zhì)的氧化不完全及發(fā)酵液中有機(jī)酸的積累;在24～96 h pH下降緩慢并逐漸平緩;而在發(fā)酵120 h之后，發(fā)酵液的pH開(kāi)始上升，之后又趨于平穩(wěn)，分析pH值上升可能是由于隨著培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗盡，微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的積累和活躍，引起培養(yǎng)液中氨基酸等的增加致使pH值上升。比較兩種通氣量，當(dāng)通氣量為5.0 m3/h時(shí)pH變化幅度較大，發(fā)酵終止時(shí)的pH高于通氣量為3.5 m3/h的發(fā)酵液pH。

2.3 不同通氣量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中溶氧濃度的影響

在好氧培養(yǎng)過(guò)程中，溶氧濃度(簡(jiǎn)稱(chēng)DO)是一個(gè)非常關(guān)鍵的控制參數(shù)，其中通氣量對(duì)于發(fā)酵罐中的溶氧濃度起到直接的作用。發(fā)酵液中的DO對(duì)微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成有著重要的影響［15－16］。DO對(duì)發(fā)酵的影響分為兩方面:一是影響與呼吸鏈有關(guān)的能量代謝，從而影響微生物生長(zhǎng);另一是直接參與產(chǎn)物合成［17－18］。谷氨酸棒桿菌 HYH3-1為兼性好氧微生物，對(duì)于氧的需求量較大，而在發(fā)酵過(guò)程中菌種只能利用發(fā)酵液中的溶解氧，因此，通過(guò)向發(fā)酵液中連續(xù)補(bǔ)充氧氣并不斷攪拌，可提高發(fā)酵液中的溶解氧。

由圖3可以看出，由于通氣量的不同，導(dǎo)致初始的DO值相差較大。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，菌種生長(zhǎng)導(dǎo)致發(fā)酵體系中溶解氧迅速降低，之后迅速增加，最后是緩慢的增加。通氣量為5 m3/h時(shí)，在24～60 h之間溶氧一直保持在較低的水平，60 h后DO值急速上升，菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期，產(chǎn)物合成階段;通氣量為3.5 m3/h時(shí)，DO在24～72 h處于低谷，在72 h時(shí)才開(kāi)始迅速上升，進(jìn)入產(chǎn)物合成階段較5 m3/h通氣量晚12 h。通氣量為5 m3/h時(shí)，更有利于菌體的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的形成，而在通氣量較大的條件下，發(fā)酵后期發(fā)酵液中的溶氧保持在較高的濃度，由此可見(jiàn)，通氣量對(duì)DO有顯著影響。

圖3 10L反應(yīng)器培養(yǎng)中不同通氣量的DO變化曲線(xiàn)Fig.3 Curve of DO in the 10 L bioreactor of different ventilation

2.4 不同通氣量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中殘?zhí)橇康挠绊?/h3>

由圖4可見(jiàn)，發(fā)酵液中初始含糖量均為200 g/L，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的谷氨酸棒桿菌HYH3-1迅速分解碳源，吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，致使糖濃度迅速下降，在發(fā)酵108 h殘?zhí)谴笾潞谋M，直至發(fā)酵結(jié)束整個(gè)體系中殘?zhí)橇渴冀K保持在很低的水平。

圖4 10 L反應(yīng)器培養(yǎng)中不同通氣量的發(fā)酵液殘?zhí)乔€(xiàn)Fig.4 Curve of glucose content in the 10 L bioreactor of different ventilation

2.5 不同通氣量對(duì)菌體干重的影響

由圖5可見(jiàn)，HYH3-1在發(fā)酵36 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生物量迅速增加;在66 h進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，在通氣量為5 m3/h和3.5 m3/h時(shí)，細(xì)胞干重分別達(dá)到16.3 g/L和15.6 g/L。結(jié)合圖3可觀察到，在快速生長(zhǎng)期溶氧下降迅速，表明此時(shí)細(xì)胞的攝氧速率明顯高于發(fā)酵液中的供氧速率，進(jìn)入穩(wěn)定期后，溶氧一直保持在較低的水平，這也可能由于生長(zhǎng)期大量菌體生長(zhǎng)需要消耗大量的溶氧。

圖5 10 L反應(yīng)器培養(yǎng)中不同通氣量的細(xì)胞干重變化曲線(xiàn)Fig.5 Curves of cell dry weight in the 10 L bioreactor of different ventilation

不同的是，較高的通氣量有利于HYH3-1的生長(zhǎng)，在通氣量為5 m3/h和3.5 m3/h時(shí)，最大細(xì)胞干重分別達(dá)到18.3 g/L和16.4 g/L。由此可見(jiàn)，在較大通氣量下，谷氨酸棒桿菌HYH3-1的菌體生長(zhǎng)較為充分。

2.6 不同通氣量對(duì)L-色氨酸合成的影響

由圖5和圖6可見(jiàn)，分批發(fā)酵中L-色氨酸的積累與菌體的生長(zhǎng)屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型。在菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，L-色氨酸合成速率較慢;當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，細(xì)胞干重的增長(zhǎng)趨勢(shì)減慢，菌體濃度保持在一個(gè)較穩(wěn)定的水平，而L-色氨酸合成速率卻有明顯的提高。由圖6可以看出，L-色氨酸的合成隨通氣量的改變而發(fā)生變化。通氣量為5 m3/h時(shí)，L-色氨酸在發(fā)酵48 h開(kāi)始大量合成;而通氣量為3.5 m3/h時(shí)，L-色氨酸的合成時(shí)間推遲到66 h，發(fā)酵終止時(shí)，L-色氨酸產(chǎn)量分別達(dá)到43.3 g/L和40.5 g/L。由此可見(jiàn)，高通氣量對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和L-色氨酸合成都有明顯的促進(jìn)作用。HYH3-1在有氧的條件下，能夠很好的利用乙醇，它分解成二氧化碳和水。維持菌體的生命，又不使它過(guò)量生長(zhǎng)，以促進(jìn)產(chǎn)酸。

圖6 10 L反應(yīng)器培養(yǎng)中不同通氣量的L-色氨酸產(chǎn)量變化曲線(xiàn)Fig.6 Curves of L-tryptophan production in the 10 L bioreactor of different ventilation

2.7 不同通氣量條件下各參數(shù)主要變化時(shí)間的比較

表1為不同通氣量條件下，細(xì)胞干重和L-色氨酸產(chǎn)量與各關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)的關(guān)系。

表1 不同通氣量下關(guān)鍵時(shí)間及細(xì)胞干重和L-色氨酸產(chǎn)量的比較Table 1 Comparison of the key time and cell dry weight and L-tryptophan production of different ventilation

由表1可以看出，不同通氣量條件下，谷氨酸棒桿菌HYH3-1進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間基本相同，都在發(fā)酵第12 h，但低通氣量延長(zhǎng)了穩(wěn)定期的時(shí)間，同時(shí)也推遲了二次生長(zhǎng)的時(shí)間。同時(shí)也不難看出，L-色氨酸的大量積累主要在谷氨酸棒桿菌HYH3-1的二次生長(zhǎng)階段，因此可將谷氨酸棒桿菌HYH3-1的發(fā)酵過(guò)程分為兩個(gè)階段:第一階段以大量積累谷氨酸棒桿菌HYH3-1細(xì)胞為主;第二階段以細(xì)胞內(nèi)合成L-色氨酸為主，同時(shí)伴有谷氨酸棒桿菌HYH3-1的二次生長(zhǎng)。

3 討論

發(fā)酵過(guò)程中通氣量的大小，對(duì)氨基酸發(fā)酵有明顯的影響。不同種齡、種量，不同的培養(yǎng)基成份，不同的發(fā)酵階段和不同大小比例的發(fā)酵罐要求是不同的。通常情況下，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，通氣量要適當(dāng)加大;培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)貧乏，通氣量要適當(dāng)減少［19］。通風(fēng)量對(duì)兼性好氧菌發(fā)酵效果影響極大，本研究首先確定了發(fā)酵過(guò)程中通風(fēng)量的維持濃度，并進(jìn)一步探討了通氣量對(duì)10 L分批發(fā)酵培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)采用5.0 m3/h通風(fēng)量時(shí)L-色氨酸產(chǎn)量較高?？赡苁怯捎诟咄饬恳种票峒っ傅幕钚詼p弱糖酵解途徑，強(qiáng)化HMP途徑，有利于L-色氨酸的合成。基因工程菌一般對(duì)氧氣需求較高，在低溶氧條件下容易產(chǎn)生乙酸等副產(chǎn)物，本研究在發(fā)酵過(guò)程中維持5.0 m3/h的通風(fēng)量即可滿(mǎn)足L-色氨酸生產(chǎn)菌HYH3-1的需要。采用上述條件在容積10 L罐上進(jìn)行8批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，L-色氨酸質(zhì)量濃度基本穩(wěn)定在40 g/L左右，發(fā)酵周期控制在120 h內(nèi)。

4 結(jié)論

在500 mL搖瓶實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行10 L生物反應(yīng)器的分批發(fā)酵培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)表明高通氣量有利于谷氨酸棒桿菌HYH3-1的生長(zhǎng)和L-色氨酸的合成，當(dāng)通氣量為5.0 m3/h時(shí)，發(fā)酵液中色氨酸產(chǎn)量和細(xì)胞干重分別為43.3 g/L和18.3 g/L，發(fā)酵過(guò)程殘?zhí)亲兓幻黠@。當(dāng)通氣量為5.0 m3/h時(shí)pH變化幅度較大，發(fā)酵終止時(shí)的pH高于通氣量為3.5 m3/h的發(fā)酵液pH。在通氣量較大的條件下，發(fā)酵后期發(fā)酵液中的溶氧保持在較高的濃度，對(duì)DO有顯著影響。

［1］趙春光，程立坤，徐慶陽(yáng)，等.微生物法生產(chǎn)L-色氨酸的研究進(jìn)展［J］.發(fā)酵科技通訊，2005，37(4):34－36.

［2］楊會(huì)琴.L-色氨酸生物技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2007，28(9):45 －48.

［3］王健，張蓓，張克旭.L-色氨酸產(chǎn)生菌的途經(jīng)分析［J］.無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，22(5):15 －18.

［4］陳俊峰，蘇麗娜，王璋，等.從土壤中分離L-色氨酸生產(chǎn)菌株及其高產(chǎn)誘變選育的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(7)37－41.

［5］Charles Yanofsky.Using studies on trytophan metabolism to answer basic biological questions［J］.The Journal of Biological Chemistry，2003，278(13)858 －878.

［6］胡耀輝，王玉華，于寒松，等.L-色氨酸的應(yīng)用及生產(chǎn)技術(shù)研究進(jìn)展［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，30(4):586－589.

［7］儲(chǔ)炬，李友榮.現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵調(diào)控學(xué)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版，2002:234－242.

［8］陳濤，陳寧.L-色氨酸的生產(chǎn)及其代謝控制育種［J］.生物技術(shù)通訊，2000(2):141－145.

［9］鄭志永，姚善徑.應(yīng)用溶氧反饋控制高密度培養(yǎng)人腸桿菌過(guò)程中乙酸的產(chǎn)生［J］.高校化學(xué)工程學(xué)報(bào)，2008，20(2):233－238.

［10］楊海軍，王健，陳寧，等.不同添加物對(duì)L-色氨酸補(bǔ)料分批發(fā)酵的影響［J］.天津科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，19(1):1 －3，8.

［11］王東陽(yáng)，蔡傳康，司汝?yáng)|，等.L-色氨酸中試生產(chǎn)研究［J］.現(xiàn)代化工，2011，31(3):73 －76.

［12］張寧.氨基酸工藝學(xué)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2007:312－322.

［13］鄧毛程.氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2007:156－176.

［14］許前會(huì)，王慧彥，李艷輝，等.對(duì)二甲胺基本甲醛分光光度法測(cè)定色氨酸［J］.甘肅科技，2006(12):50－53.

［15］周小萍，楊海軍.L-色氨酸5L罐發(fā)酵條件的研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊，2005(8):51－53.

［16］吳有煒.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理［M］.蘇州:蘇州大學(xué)出版社，2002.

［17］劉燕，魏愛(ài)英，孟剛，等.采用補(bǔ)料生物反應(yīng)器對(duì)產(chǎn)L-色氨酸發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.發(fā)酵科技通訊，2013(1):1－3.

［18］鄭輝.L-色氨酸發(fā)酵條件研究［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，15(3):159－16.

［19］發(fā)酵過(guò)程通氣量大小對(duì)谷氨酸發(fā)酵有何影響［J］.發(fā)酵科技通訊，2010，39(1):7.