張麟，蔡國林，高獻禮，陸健，董建軍，余俊紅，楊梅

1(啤酒生物發(fā)酵工程國家重點實驗室，山東 青島，266000)

2(江南大學糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇無錫，214122)

啤酒糟(Brewer’s Spent Grain，BSG)是啤酒釀造過程中產生的副產品，粗蛋白含量在25%左右［1］，是一種潛在的蛋白飼料原料。然而，BSG的蛋白品質不佳，跟豆粕和魚粉等相比，多肽含量較少，蛋白質的消化、吸收率較低，賴氨酸和蛋氨酸等必需氨基酸比較缺乏［2－4］，同時啤酒糟中的蛋白類物質被纖維木質素類物質包裹，不易被釋到細胞外，更加難以被生物利用，這些缺陷導致其飼用品質不高，價值較低。

對啤酒糟進行機械預處理，可以使蛋白類物質釋放到胞外，更利于蛋白質與酶接觸，使得飼料更易受消化酶作用［5］。對啤酒糟進行液態(tài)酶解，獲得蛋白肽，可以避免大分子蛋白對動物的致敏性，且小分子蛋白更容易被動物消化、吸收，同時具有促進免疫，調節(jié)激素的功能［6］。盧虹［7］等人用中性蛋白酶酶解未經機械預處理的啤酒糟，由于啤酒糟樣品細胞壁結構的復雜性，導致產品的蛋白質含量低，酶解后得到的水溶性蛋白、多肽含量同樣較低。而彭元懷［8］等人利用魚粉制備飼用蛋白肽的成本較高，并且成品帶有腥味，不適合大規(guī)模的應用。

本研究通過機械方法對啤酒糟進行預處理，并對機械預處理過后的啤酒糟進行液態(tài)酶解，研究機械預處理和液態(tài)酶解對制備飼料蛋白肽的影響，同時對液態(tài)酶解的條件進行均勻設計優(yōu)化，考察加酶量、溫度、pH和酶解時間對啤酒糟酶解效率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

啤酒糟由青島啤酒上海松江有限公司提供。

1.1.2 實驗所用主要試劑

NaOH、H2SO4、K2SO4、CuSO4、甲基紅、溴甲酚綠等均為國藥集團藥品，中性蛋白酶(MAXAZYME NNP DS)由帝斯曼(中國)有限公司提供。

1.1.3 儀器與設備

DT260半自動凱氏定氮儀，福斯賽諾(蘇州)分析儀器有限公司;DT208消化爐，福斯賽諾(蘇州)分析儀器有限公司;UV-2100紫外分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司;Q-150A3刀片粉碎機，上海冰都電器有限公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司;XQM-2L實驗行星球磨機，長沙天創(chuàng)粉末技術有限公司;PL2002/EL204電子天平，METTLER TOLEDO(上海)有限公司。

1.2 啤酒糟的預處理

含水量為60%左右的啤酒糟經過60℃干燥成為啤酒糟原樣。機械預處理方式為200 g樣品經刀片粉碎5 min。

啤酒糟粉碎分級和球磨:經過刀片粉碎的啤酒糟用60目篩篩分，獲得能通過60目篩的篩下物。篩下物進行球磨，得到篩下物球磨樣品。

1.3 酶活測定

中性蛋白酶酶活測定:于40℃、pH 7.2的條件下，1 min水解酪素產生1 μg酪氨酸的酶量稱為1個酶活力單位(U)［9］。

1.4 粗蛋白含量

粗蛋白含量的測定:凱氏定氮法［10］。

1.5 水溶性蛋白含量和多肽含量測定

水溶性蛋白含量測定:凱氏定氮法［11］。

多肽含量測定:按照參考文獻進行測定［12］。

1.6 酶解條件優(yōu)化

1.6.1 單因素試驗

啤酒糟2 g，加入酶液10 mL，在初始條件:加酶量1 800 U/g，酶解溫度40℃，pH 7.2，酶解時間1 h下進行酶解。

主要研究溫度、pH、加酶量和酶解時間對啤酒糟水溶性蛋白含量的影響。

1.6.2 均勻設計實驗

選取4個單因素進行5水平，N=10的DPS設計，每組試驗重復進行3次，以水溶性蛋白含量為響應值，用DPS軟件對試驗結果進行二次多項式逐步回歸分析，以考察各因素交互作用和最適條件。

1.7 飼用蛋白肽的制備

對酶解液進行真空冷凍干燥，干燥后粉碎即為飼用蛋白肽。

2 結果與討論

2.1 機械預處理對啤酒糟粗蛋白和水溶性蛋白含量的影響

對啤酒糟進行刀片粉碎過篩，篩下物球磨之后，粗蛋白含量和水溶性蛋白含量的變化如圖1所示。

圖1 機械預處理對啤酒糟粗蛋白和水溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of mechanical pretreatment on BSG crude protein content and soluble protein content

經過機械預處理后，篩下物球磨啤酒糟粗蛋白含量上升到38.8%，比原樣中粗蛋白含量提高了36.1%。篩下物球磨啤酒糟水溶性蛋白含量上升到2.53%，比原樣中水溶性蛋白含量提高了3.1倍。原因是蛋白類的物質結合力不如纖維類物質緊密，在粉碎處理過程中與纖維類物質的附著發(fā)生分離，并且由于蛋白類物質的粒徑較纖維類物質要細小，在篩分過程中與纖維類物質分離，造成了篩下啤酒糟粗蛋白含量比啤酒糟原樣粗蛋白含量高。

水溶性蛋白含量提高的原因可能是經過機械預處理后，原來啤酒糟中的細胞結構被破壞，其中的蛋白類物質釋放到胞外，同時之前和纖維木質素類物質結合的蛋白類物質，在處理過程中也與纖維木質素類物質分離，這兩種因素綜合起來，導致機械預處理后的篩下物球磨啤酒糟水溶性蛋白含量顯著提高。綜上所述，機械預處理對啤酒糟中的粗蛋白含量和水溶性蛋白含量變化有著顯著影響。

對篩下物啤酒糟和啤酒糟原樣進行中性蛋白酶的液態(tài)酶解，酶解后水溶性蛋白含量如圖2所示。兩個樣品經過液態(tài)酶解之后，水溶性蛋白含量提高明顯，篩下物球磨啤酒糟水溶性蛋白含量達到12.85%，比原樣的7.88%提高了1.6倍，說明機械預處理能夠有效提高酶解效率。

圖2 酶解對啤酒糟粗蛋白和水溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of enzyme hydrolysis on BSG crude protein content and soluble protein content

2.2 篩下物球磨啤酒糟酶解條件優(yōu)化

啤酒糟經刀片粉碎篩分后再球磨，可以大幅度降低啤酒糟中各聚合物的交聯(lián)和取代，而這些聚合物往往會和酶通過非特異性結合，影響酶的活力。同時，粉碎和球磨處理可以降低啤酒糟的粒徑和纖維素的結晶度［12］，粒徑的降低使酶接觸的有效表面積增加，酶與木質纖維素之間的非特異性結合減少，酶解效率大大提高。

2.2.1 加酶量對啤酒糟水溶性蛋白含量變化的影響

由圖3可知，隨著中性蛋白酶用量的增加，水溶性蛋白含量也隨之增加。在酶添加量達到2 400 U/g時，進一步提高加酶量，水溶性蛋白含量不再明顯提高。這是由于酶量的增大，酶與底物接觸的機會增加，從而促進了酶解的進行，但是底物分子的有效酶作用位點是有限的，當酶與底物的有效接觸達到飽和狀態(tài)時，酶量的增加將不再引起水溶性蛋白含量的增加。超過2 400 U/g的加酶量，酶成本的投入增加，但是水溶性蛋白含量沒有明顯提升，考慮到成本等因素，故選擇2 400 U/g為酶解時的加酶量。

圖3 加酶量對啤酒糟水溶性蛋白含量的影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on BSG soluble protein content

2.2.2 溫度對啤酒糟水溶性蛋白含量變化的影響

調節(jié)酶解溫度分別為35、40、45、50和55℃，考察酶解溫度對水溶性蛋白含量變化的影響。由圖4可知，篩下物球磨啤酒糟經中性蛋白酶酶解，隨著溫度的升高，水溶性蛋白含量逐漸增高，在45℃達到最大值16.2%。當溫度高于45℃時，水溶性蛋白含量開始降低。溫度對酶促反應速率的影響表現(xiàn)在兩個方面，一方面是當溫度升高時，與一般化學反應一樣，反應速率加快;另一方面由于酶是蛋白質，當溫度繼續(xù)上升時，使酶蛋白逐漸變性而失活，引起酶反應速率下降。酶所表現(xiàn)的最適溫度是這兩種影響的綜合結果。在酶反應的初始階段，酶蛋白的變性尚未表現(xiàn)出來，因此反應速率隨溫度升高而增加，但高于最適溫度時，酶蛋白變性逐漸突出，反應速率隨溫度升高的效應將逐漸為酶蛋白變性效應所抵消，反應速率下降，因此表現(xiàn)出最適溫度。故選擇45℃為酶解時溫度。

2.2.3 pH對啤酒糟水溶性蛋白含量變化的影響

在上述酶解條件下，調節(jié)緩沖液pH，考察不同pH對水溶性蛋白含量變化的影響。由圖5可知，篩下物球磨啤酒糟經中性蛋白酶酶解，隨pH升高，水溶性蛋白含量升高，當pH達到8.0時，水溶性蛋白含量達到最大值17.8%，繼續(xù)提高酶解pH，水溶性蛋白含量下降。

圖4 溫度對啤酒糟水溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effect of temperature on BSG soluble protein content

圖5 pH對啤酒糟水溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of pH on BSG soluble protein content

pH影響酶活力的原因可能是過酸或過堿可以使酶的空間結構受到破壞，引起酶構象的改變，酶活性喪失。當pH改變不很劇烈時，酶雖未變性，但活力受到影響。其次，pH還影響底物的解離狀態(tài)，或者使底物不能和酶結合，或者結合后不能生成產物;再次，pH影響酶分子活性部位上有關基團的解離，從而影響與底物的結合或者催化，使酶活性降低;最后，pH影響維持酶分子空間結構的有關基團解離，從而影響了酶活性部位的構象，進而影響酶的活性。酶在最適pH時所處的某一種解離狀態(tài)，最有利于與底物結合并發(fā)生催化作用，活力最高。故選擇8.0為酶解pH值。

2.2.4 酶解時間對啤酒糟水溶性蛋白含量變化的影響

在上述酶解條件下，調整酶解時間分別為1、2、4、8、16和24 h，考察不同酶解時間對水溶性蛋白含量的影響。由圖6可知，酶解時間在1～8 h，水溶性蛋白含量不斷提高，在8 h時，水溶性蛋白含量達到20.45%，之后隨著酶解時間的延長，水溶性蛋白含量的增加趨于平緩。造成這種現(xiàn)象的原因可能是酶可以接觸到的底物逐漸減少，并且酶活性降低所致，故選擇8 h為最佳酶解時間。

圖6 酶解時間對啤酒糟水溶性蛋白含量的影響Fig.6 Effect of hydrolysis time on BSG soluble protein content

2.2.5 均勻設計優(yōu)化

根據以上單因素實驗結果，以水溶性蛋白含量為指標，選擇加酶量、酶解溫度、酶解pH和酶解時間4個因素建立均勻設計。利用Data Processing System數據處理系統(tǒng)設計實驗方案并對方案進行優(yōu)化［13］，表1為均勻設計方案表。

表1 DPS實驗方案設計表Table 1 DPS experimental design table

表1中的方案CD=0.185 6，較大。為了建立更全面的回歸模型，表中的實驗量要增加1倍，得到CD=0.101 4，表 2 顯示的為實驗結果［13］。

表2 DPS混合設計表Table 2 DPS mixed design table

利用DPS7.05軟件，以水溶性蛋白含量為考察對象，對表2的結果進行回歸擬合分析。

考察對象為水溶性蛋白含量，得到回歸方程:

Y=16.37+0.88X1+2.42X2+0.93X3－0.63X4－0.42X2X2－0.22X3X3－0.08X1X3+0.26X3X4

對模型進行顯著性分析，結果見表3。

方程相關系數R=0.999 2，顯著水平P=0.009 4，方程顯著。由DPS軟件分析可知，水溶性蛋白含量最高時各因素的組合:加酶量2 400 U/g，酶解溫度45℃，酶解pH 8.0，酶解時間8 h，水溶性蛋白含量的預測值為21.34%。

表3 對水溶性蛋白含量模型的顯著性分析Table 3 Analysis of significance model of soluble protein content

2.2.6 驗證實驗

控制酶解條件為加酶量2 400 U/g，酶解溫度45℃，酶解pH 8.0，酶解時間8 h，實驗重復3次取平均值。水溶性蛋白含量為21.31%，提取率為54.9%，與預測值接近，優(yōu)化結果有效。

2.3 飼用蛋白肽品質分析

采用上述最優(yōu)條件對啤酒糟進行液態(tài)酶解，對酶解液進行真空冷凍干燥，獲得飼用蛋白肽，其粗蛋白含量為78.8%。酶解液中的水溶性蛋白經過干燥后都以固態(tài)的形式保留在飼用蛋白肽中，其中氨基酸含量達到74.6%。氨基酸組成含量如表4所示。

飼用蛋白肽中的必需氨基酸含量達到了28.18%，可以有效降低飼養(yǎng)成本，提高動物的生長效率，賴氨酸和蛋氨酸是豬飼料中的第一限制性氨基酸，對豬的生長和料肉比有顯著影響［14］。飼用蛋白肽中賴氨酸和蛋氨酸含量分別達到了2.55%和1.12%，基本上能夠滿足動物的生長需要。

飼用蛋白肽中多肽含量達到了60.8%，多肽可以增加蛋白質溶解性，提高消化率，作為蛋白質的降解產物更加利于牲畜的消化吸收，刺激動物的食欲，促進牲畜的生長、調節(jié)免疫，從而提高飼料轉化率和肉質等［15］。

表4 飼用蛋白肽與啤酒糟中氨基酸組成對比Table 4 Comparison of amino acid composition between feed protein peptides and BSG

3 結論

啤酒糟經過機械預處理后，篩下物球磨啤酒糟粗蛋白含量提高到38.8%，比原樣提高了36.1%，水溶性蛋白含量提高到2.53%，比原樣提高了3.1倍。對篩下物球磨啤酒糟進行中性蛋白酶液態(tài)酶解，水溶性蛋白含量達到12.85%，說明機械預處理對酶解效率有顯著的提高。在單因素實驗的基礎上，選取加酶量、酶解溫度、酶解pH和酶解時間4個因素進行混合水平均勻設計實驗，確定最優(yōu)酶解條件:加酶量2 400 U/g，酶解溫度45℃，酶解pH 8.0，酶解時間8 h，此時水溶性蛋白含量達到21.31%。對酶解液進行真空冷凍干燥，制備飼用蛋白肽，其中粗蛋白含量為78.8%，氨基酸含量達到74.6%，必需氨基酸含量達到28.18%，多肽含量達到60.8%。

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