范金波，蔡茜彤，侯宇，周素珍，馮敘橋

(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧錦州，121013)

近年來，食物過敏現(xiàn)象逐年增多，已成為人類營(yíng)養(yǎng)尤其是兒童營(yíng)養(yǎng)中的一個(gè)重要的社會(huì)健康問題。調(diào)查表明，公眾自訴有食物過敏史的大約有15%，約8%小于3歲的兒童有過食物過敏經(jīng)歷。在美國(guó)、歐洲等發(fā)達(dá)地區(qū)，已經(jīng)十分重視食物過敏的研究與防治，而在我國(guó)，食物過敏問題還沒有引起足夠的重視，對(duì)食物過敏方面的研究報(bào)道較少［1-2］。

牛乳是優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)食品，但也是較易引起過敏反應(yīng)的食物之一，約有2%～6%的嬰幼兒對(duì)牛乳蛋白有不同程度的過敏。研究表明，α-乳白蛋白(α-LA)、β-乳球蛋白和酪蛋白是牛乳中引起過敏反應(yīng)的主要乳蛋白。目前，α-LA由于富含必需氨基酸、營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)常添加到嬰幼兒配方奶粉、乳飲料及運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中［3］，但是α-LA的抗原性嚴(yán)重影響了α-LA的應(yīng)用。因此，探索合適的加工方式來降低牛乳α-LA的致敏性，對(duì)于提高牛乳制品的安全性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。在蛋白質(zhì)改性技術(shù)中，糖基化改性被認(rèn)為是最安全、最有前景的降低牛乳蛋白致敏性的改性方法。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)應(yīng)用糖基化降低乳蛋白致敏性的研究較少，尤其是對(duì)糖的選擇方面，缺乏理論基礎(chǔ)。有研究表明，在蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)中糖鏈長(zhǎng)度對(duì)于糖基化蛋白性能的提高起著十分重要的作用。與單糖、雙糖相比，添加多糖可增加蛋白質(zhì)的功能特性，包括熱穩(wěn)定性、乳化性等［4］。然而，對(duì)于糖基化反應(yīng)中糖鏈長(zhǎng)度對(duì)于蛋白質(zhì)抗原性的影響未有報(bào)道。因此，本研究利用α-乳白蛋白(α-LA)-糖復(fù)合物，研究糖鏈長(zhǎng)度對(duì)α-LA-糖復(fù)合物抗原性的影響，為低敏性乳制品的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白酶，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;甲醇(色譜級(jí))，購(gòu)自美 國(guó) Fisher 公 司;NaCl、KCl、KH2PO4、K2HPO4·12H2O、NaOH均為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

電子天平(ALC-210)，美國(guó)Satorious公司;酶標(biāo)儀(M680)，美國(guó)伯樂公司;高效液相色譜(1100)，美國(guó)Agilent公司;微量振蕩器(ZW-A)，江蘇省壇金市熒華儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 α-乳白蛋白-糖復(fù)合物的制備

將α-LA和不同碳鏈長(zhǎng)度的還原寡糖(葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖)按摩爾比1∶13溶解于去離子水中，制成最終蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的混合液，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至8.0，冷凍干燥。將凍干的混合物粉末放入培養(yǎng)皿中，保持相對(duì)濕度在65%(飽和KBr溶液)左右，放入培養(yǎng)箱中，55 ℃ 下進(jìn)行糖基化反應(yīng)，分別于 0、12、24、36、48 h取出混合物，所得α-LA-糖復(fù)合物溶解于去離子水中，溶液最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，透析除去未反應(yīng)的糖及鹽分，再次凍干，得到的凍干粉于-20℃保存。同時(shí)，將不加入糖的α-LA在相同條件下處理作為對(duì)照(ct)。

1.2.2 糖基化反應(yīng)程度的測(cè)定

采用鄰苯二甲醛法(OPA法)［5］。準(zhǔn)確稱取40 mg的OPA溶解于1 mL的甲醇中，分別加入20%(w/v)的 SDS 2.5 mL、0.1 mol/L 的硼砂 25 mL、100 μL β-巰基乙醇，最后用去離子水定容至50 mL，此為OPA試劑。測(cè)定時(shí)取50 μL的樣品(蛋白濃度2 mg/mL)與1 mL OPA溶液混合，室溫放置2 min。反應(yīng)完畢后，于340 nm下測(cè)其吸光值A(chǔ)1，以在OPA試劑中加入50 μL去離子水為空白樣，兩者之差ΔA為自由氨基的凈吸光值。用濃度為(0.25～2.00)×10-3mol/L賴氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換成賴氨酸的濃度。游離氨基酸殘留量即為糖基化反應(yīng)后的α-LA-糖中游離氨基酸的濃度與未反應(yīng)的α-LA中游離氨基酸的濃度的比值。

1.2.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定α-乳白蛋白及復(fù)合物的抗原性

前期通過α-LA免疫新西蘭大白兔，制備了兔抗α-乳白蛋白的多克隆抗體。經(jīng)測(cè)定最高效價(jià)達(dá)到了1∶256 000;同時(shí)，所制備的抗體與乳中其他主要蛋白質(zhì)不存在免疫交叉反應(yīng)，特異性良好，利用此抗體測(cè)定α-乳白蛋白的抗原性，過程如下:

(1)抗原包被:用包被液(濃度為50 mmol/L，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液)稀釋?duì)?LA至質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，100 μL/孔加入96 孔酶標(biāo)板，于4 ℃放置過夜。

(2)樣品和抗血清預(yù)混合:在反應(yīng)管中加入蛋白質(zhì)量濃度為0.1 g/L的樣品和相同體積一定稀釋度(α-LA，1∶64 000)的抗血清，不加樣品的反應(yīng)管作為無(wú)競(jìng)爭(zhēng)體系，4℃放置過夜，次日傾去孔內(nèi)液體，PBST(PBS+0.05%Tween-20)洗滌3次，拍干。

(3)封閉:加封閉液(含0.1 g/L明膠的包被液)進(jìn)行封閉，100 μL/孔，37 ℃ 放置 1 h，PBST 洗滌 3次，拍干。

(4)抗原抗體反應(yīng):加入(2)中樣品和抗血清的預(yù)混合液，100 μL/孔，37 ℃ 溫育 1 h，PBST 洗滌 3次，拍干。

(5)加酶標(biāo)二抗:用封閉液將HRP-羊抗兔IgG稀釋 5 000 倍，100 μl/孔，37 ℃溫育1 h，PBST 洗滌3次，拍干。

(6)顯色:加新鮮配制的 TMB底物溶液，100 μL/孔，37℃暗處反應(yīng)15 min，顯示藍(lán)色。

(7)終止反應(yīng):加濃度為2 mol/L的H2SO4，50 μL/孔終止反應(yīng)，顏色變黃。

(8)吸光值測(cè)定:利用酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光值。

(9)數(shù)據(jù)處理:被測(cè)物殘留的抗原性大小用其抗原抑制率來評(píng)價(jià)，按下式計(jì)算:

式中:B為被測(cè)樣的A值;B0為無(wú)競(jìng)爭(zhēng)體系的A值。

1.2.4 糖基化位點(diǎn)分析

采用胰蛋白酶酶解糖基化后的樣品，酶與底物摩爾比1∶100，在37℃下進(jìn)行并調(diào)節(jié)樣品至pH 8.5，酶解2 h后滅酶，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析糖基化蛋白酶解產(chǎn)物，根據(jù)蛋白一級(jí)序列分析其糖基化位點(diǎn)。

色譜條件:Zobalx SB-C18色譜柱(2.1 mm ×150 mm)。洗脫速度為0.2 mL/min，流動(dòng)相分別為5%～45%的緩沖液A(三氟乙酸∶水=體積比0.1∶99.9)，洗脫 50 min;45%～60%緩沖液 A，洗脫5 min;60%～90%的洗脫液A，洗脫65 min。質(zhì)譜條件:噴霧電壓為3.5 kV，干燥氣溫度為300℃，質(zhì)量掃描范圍300～2 000 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化反應(yīng)程度的測(cè)定

糖基化反應(yīng)的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)中氨基酸側(cè)鏈(主要為賴氨酸的ε-氨基)與還原糖的還原性羰基末端反應(yīng)，得到共價(jià)復(fù)合物。所以，通過測(cè)定糖基化前后的自由氨基殘留量的變化可以定量分析α-LA糖基化反應(yīng)程度。如圖1所示，所有糖基化的α-LA-糖復(fù)合物中的游離氨基酸殘留量均隨反應(yīng)時(shí)間的增加而降低，表明α-LA與還原糖之間發(fā)生了交聯(lián)。其中，單糖與α-LA混合物游離氨基酸降低最快，在處理48 h后，葡萄糖-α-LA的游離氨基酸殘留量為40.59%。在與其他糖的反應(yīng)中，游離氨基酸降低較慢，麥芽糖-α-LA、麥芽三糖-α-LA、麥芽四糖-α-LA 和麥芽五糖-α-LA的游離氨基酸殘留量分別為50.49%、57.98%、70.38%和72.94%。結(jié)果表明，與α-LA的糖基化反應(yīng)中，糖的反應(yīng)性由高到低分別為:葡萄糖＞麥芽糖＞麥芽三糖＞麥芽四糖＞麥芽五糖。糖基化程度以及反應(yīng)速率隨糖鏈長(zhǎng)度的增加而降低，可能是由不同分子大小的糖所引起的結(jié)合位阻不同而引起的［6］。糖鏈越短，所含的開鏈形式越多，糖與蛋白質(zhì)中氨基的反應(yīng)活性就越強(qiáng)［7-8］。

圖1 糖鏈長(zhǎng)度對(duì)自由氨基殘留量的影響Fig.1 Effect of saccharide size on free amino groups of glycated α-LA

2.2 α-乳白蛋白-糖復(fù)合物抗原性分析

圖2顯示的是不同鏈長(zhǎng)寡糖糖基化產(chǎn)物抗原性的變化。在55℃加熱條件下，未經(jīng)過糖基化的α-LA的抗原性伴隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)稍有提高，這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的熱處理，使α-LA的構(gòu)象改變，蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的展開導(dǎo)致分子內(nèi)部的部分抗原決定簇暴露［9］，這與 Kleber［10］等人研究 β-LG 加熱條件下抗原性變化的趨勢(shì)一致。

5種糖基化樣品的抗原性與原α-LA蛋白相比，抗原性均有明顯下降。α-LA的抗原性隨糖基化反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)而降低，說明糖基化程度對(duì)于降低蛋白質(zhì)抗原性起著十分重要的作用。被引入的糖分子通過空間位阻和電荷作用，掩蔽蛋白上的抗原決定簇，從而降低α-LA的抗原性［11］。然而，抗原性降低效果最好的是麥芽三糖-α-LA復(fù)合物，48h糖基化處理后，α-LA的抗原抑制率達(dá)到51.67%，但是由糖基化反應(yīng)程度結(jié)果看，麥芽三糖-α-LA的糖基化程度并不是最高的。這說明，糖與蛋白的結(jié)合部位可能對(duì)其抗原性起到更為關(guān)鍵的作用。

圖2 糖鏈長(zhǎng)度對(duì)α-乳白蛋白抗原性的影響Fig.2 Effect of saccharide size on the antigenicity of α-LA

2.3 糖基化位點(diǎn)分析

圖3為葡萄糖-α-LA糖基化樣品的酶切肽段的ESI質(zhì)譜圖，其中，經(jīng)過分子質(zhì)量對(duì)比分析(有1分子葡萄糖加入到肽段上，肽段分子質(zhì)量增加162)得出糖基化肽段有6條，分別為肽段(17～62)、(59～79)、(80～94)、(95～108)、(99～114)和(109～122)。結(jié)果表明，葡萄糖糖基化樣品中，Lys58、Lys62、Lys93、Lys98、Lys108以及 Lys1146個(gè)賴氨酸殘基被糖基化。利用同樣的方法，分析麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖及麥芽五糖糖基化產(chǎn)物的糖基化位點(diǎn)，如表1所示。對(duì)比5種還原糖的糖基化位點(diǎn)及其糖基化產(chǎn)物的抗原性，我們發(fā)現(xiàn)Lys58糖基化位點(diǎn)可能對(duì)于α-LA的抗原性起重要作用。Lys58位點(diǎn)僅在抗原性降低最多的葡萄糖-α-LA和麥芽三糖-α-LA中被糖基化。由于糖基化作用是通過被引入的糖分子的空間位阻和電荷作用，掩蔽蛋白上的抗原決定簇，從而降低蛋白的過敏原性。因此，我們判斷Lys58位點(diǎn)位于α-LA的抗原決定簇序列上。Maynard［12］等人的研究也指出，肽段(17～58)以及包含此段氨基酸序列的更大肽段與IgE有強(qiáng)烈的反應(yīng)，表明肽段(17～58)為α-LA的主要抗原決定簇。綜合以上結(jié)果說明糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的抗原性受糖基化程度及糖基化位置的共同影響。

圖3 葡萄糖-α-LA的糖基化肽段(80～94，95～108，109～122)Figure 3 Sequences correspond to glycated peptides of

表1 α-乳白蛋白糖基化樣品胰蛋白酶酶解肽段質(zhì)譜分析Table 1 HPLC-MS/MS analysis of peptides obtained from the trypsin digestion of glycated α-LA after glycation

3 結(jié)論

本文重點(diǎn)研究了5種不同糖鏈長(zhǎng)度的糖與α-乳白蛋白糖基化反應(yīng)對(duì)后者抗原性的影響，結(jié)果表明糖基化程度隨糖鏈長(zhǎng)度的增長(zhǎng)而降低。此外，經(jīng)過糖基化反應(yīng)α-LA抗原性顯著下降，并且α-LA的抗原性隨糖基化反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)而降低，說明糖基化程度對(duì)于降低蛋白質(zhì)抗原性起著十分重要的作用。但是抗原性降低幅度最大的是麥芽三糖-α-LA，進(jìn)一步通過測(cè)定糖基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)Lys58位點(diǎn)僅存在于抗原性降低最多的葡萄糖-α-LA和麥芽三糖-α-LA中，說明α-LA糖基化產(chǎn)物的抗原性受糖基化程度及糖基化位點(diǎn)的共同影響。

［1］包怡紅.乳清多肽及其發(fā)酵制品的研究［D］.哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2001:11-34.

［2］Maldonado J，Gil A，Narbona E，et al.Special formulas in infant nutrition:a review［J］.Early Human Development，1998，53(1):S23-S32.

［3］L?nnerdal B，Lien E L.Nutritional and physiologic significance of α-lactalbumin in infants［J］.Nutrition Reviews，2003，61(9):295-305.

［4］Shu Y W，Sahara S，Nakamura S，et al.Effects of the length of polysaccharide chains on the functional properties of the Maillard-type lysozyme-polysaccharide conjugate［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1996，44(9):2 544-2 548.

［5］Fayle S E，Healy J P，Brown P A，et al.Novel approaches to the analysis of the Maillard reaction of proteins［J］.E-lectrophoresis，2001，22(8):1 518-1 525.

［6］Nacka F，Chobert J M，Burova T，et al.Induction of new physicochemical and functional properties by the glycosylation of whey proteins［J］.Journal of Protein Chemistry，1998，17(5):495-503.

［7］Chevalier F，Chobert J M，Popineau Y，et al.Improvement of functional properties of β-lactoglobulin glycated through the Maillard reaction is related to the nature of the sugar［J］.International Dairy Journal，2001，11(3):145-152.

［8］Pokharna H K，Pottenger L A.Nonenzymatic glycation of cartilage proteoglycans:an in vivo and in vitro study［J］.Glycoconjugate Journal，1997，14(8):917-923.

［9］Kleber N，Hinrichs J.Antigenic response of β-lactoglobulin in thermally treated bovine skim milk and sweet whey［J］.Milchwissenschaft，2007，62(2):121-124.

［10］Kleber N，Krause I，Illgner S，et al.The antigenic response of β-lactoglobulin is modulated by thermally induced aggregation［J］.European Food Research and Technology，2004，219(2):105-110.

［11］Arita K，Babiker E E，Azakami H，et al.Effect of chemical and genetic attachment of polysaccharides to proteins on the production of IgG and IgE［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(4):2 030-2 036.

［12］Maynard F，Jost R，Wal J M.Human IgE binding capacity of tryptic peptides from bovine α-lactalbumin［J］.International Archives of Allergy and Immunology，1997，113(4):478-488.