馮 越 蔡士昌 蔡朋朋 李雪松 孫智睿 費(fèi)洪新 徐廣有

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 2009級(jí)學(xué)生，黑龍江齊齊哈爾 161000；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬三院消化科，黑龍江齊齊哈爾 161000；3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬三院心內(nèi)科，黑龍江齊齊哈爾 161000；4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院組胚室，黑龍江齊齊哈爾 161000；5.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院微形態(tài)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161000

大腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的腫瘤，已躍居成為惡性腫瘤死因的第4位[1]。大腸癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段、多步驟的過(guò)程，涉及一系列調(diào)控基因和因子的變化，其中TGF-β/Smads信號(hào)傳導(dǎo)通路是控制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的重要通路，在腫瘤的發(fā)生，發(fā)展過(guò)程中具有重要的作用。三氧化二砷(As2O3)的抗腫瘤效果已得到多數(shù)學(xué)者肯定[2-4]，As2O3主要是通過(guò)抑制細(xì)胞增值，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡起到抗腫瘤的目的，三氧化二砷對(duì)體外腸癌細(xì)胞的作用，國(guó)內(nèi)研究較少，先期研究已經(jīng)表明As2O3對(duì)腸癌HCT116細(xì)胞具有明顯抑制作用，且隨濃度增加而增強(qiáng)，本研究繼續(xù)將三氧化二砷作用于腸癌HCT116細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光化學(xué)術(shù)，Western blotting觀察 TGF-β/Smads信號(hào)通路中重要基因Smad3、Smad7在人低分化結(jié)腸腺癌細(xì)胞株HCT-116中的表達(dá)，及AS2O3干預(yù)前后的變化情況，闡述TGF-β/Smads信號(hào)通路中Smads相關(guān)分子在腸癌HCT116細(xì)胞中有關(guān)分子的變化規(guī)律，探討腸癌發(fā)生的病理機(jī)制和分析As2O3作用新靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

As2O3購(gòu)自哈爾濱伊達(dá)藥業(yè)，人腸癌細(xì)胞HCT116由中科院上海細(xì)胞庫(kù)提供，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO公司，OLYMPUS倒置顯微鏡由奧地利生產(chǎn)，Smads抗體購(gòu)于博奧森公司，其余二抗等購(gòu)于武漢博士得公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇后的HCT116細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,加入1640培養(yǎng)液(含熱滅活胎牛血清,2 g/LNaHCO3,青霉素和鏈霉素各100 mg/L)中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(條件為37℃，5%CO2濃度及飽和濕度)，然后用0.15%胰蛋白酶消化傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組及藥物處理

將5×104個(gè)/mL單細(xì)胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板中，其中空白對(duì)照組加10%的培養(yǎng)液,用于試驗(yàn)的低劑量組加入0.5μmol/L濃度的As2O3，中劑量組加1.5μmol/L As2O3，高劑量組加2.5μmol/L的As2O3液,在培養(yǎng)72 h后取出細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 間接免疫熒光術(shù)檢測(cè)Smad3、Smad7蛋白的表達(dá)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116細(xì)胞,用0.15%胰酶消化成單細(xì)胞懸液后,以1×105/mL細(xì)胞濃度接種在放有玻片的24孔培養(yǎng)板中,1 mL/孔，37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)72 h,待細(xì)胞貼壁后,棄去上清液,換成無(wú)血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸盡上清液，PBS洗5 min×3次，取出玻片，中性樹膠封片（有細(xì)胞面向上），過(guò)夜晾干，4℃保存?zhèn)溆茫g接免疫熒光術(shù)檢測(cè)，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作（Smad 蛋白抗體濃度為 1∶100,熒光抗體濃度為 1∶50），用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果以熒光強(qiáng)度表示。

1.5 westernblotting檢測(cè)Smads相關(guān)蛋白表達(dá)

將上述各組As2O3處理過(guò)的培養(yǎng)細(xì)胞,用PBS進(jìn)行漂洗，裂解細(xì)胞,離心然后灌凝膠上樣，將蛋白樣品加入50μg/孔電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜然后上搖床后用TBS封閉抗原1 h，加入一抗（Smad3、Smad7）,4℃過(guò)夜，TBS洗膜后加入二抗稀釋液(用封閉液進(jìn)行稀釋，稀釋濃度為1∶2000)室溫孵育膜lh，TBS洗膜3次，βactin為參照，拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，比較用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光化學(xué)術(shù)檢測(cè)Smad3,Smad7蛋白表達(dá)

見(jiàn)表1。

表1 As2O3作用下HCT116細(xì)胞Smads蛋白熒光強(qiáng)度值()

表1 As2O3作用下HCT116細(xì)胞Smads蛋白熒光強(qiáng)度值()

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

名稱Smad3 Smad7空白對(duì)照組0.5μmol/L As2O3 組 *1.5μmol/L As2O3 組 *2.5μmol/L As2O3 組 *16.61±0.6419.94±1.5734.17±1.2839.64±1.6338.61±0.6431.53±0.6721.69±0.9420.04±0.31

2.2 Westernblotting檢測(cè)Smads相關(guān)基因

Smad3蛋白：對(duì)照組，及各濃度As2O3組相比較，Smad3蛋白表達(dá)逐漸增高，說(shuō)明隨著腫瘤細(xì)胞抑制作用的增加，Smad3表達(dá)增多，調(diào)控其下游信號(hào)的傳導(dǎo)。見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)照，0.5μmol/L，1.5μmol/L，2.5μmol/L As2O3，β-actin

Smad7蛋白的表達(dá)：對(duì)照組，以及各濃度As2O3相比，Smad7蛋白表達(dá)逐漸減少，表明隨As2O3濃度的增加，腫瘤細(xì)胞的受到抑制的作用增強(qiáng)，Smad7表達(dá)減少，減弱了對(duì)TGF-β/Smads信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。見(jiàn)圖3。

圖3 對(duì)照，0.5μmol/L，1.5μmol/L，2.5μmol/L As2O3，β-actin

3 討論

研究顯示,與腫瘤發(fā)生高度相關(guān)的TGF-β/Smads信號(hào)通路由TGF-β超家族及其受體,Smads蛋白及其調(diào)節(jié)基因組成。TGF-β/Smads通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)表達(dá)的異常，而使腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為改變[5]。目前比較清楚的是，在腫瘤發(fā)展的早期，TGF-β1能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，使細(xì)胞停留在G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但在腫瘤晚期，該信號(hào)通路中的一些因子發(fā)生突變，使腫瘤細(xì)胞能夠逃逸TGF-β1的抑制作用而發(fā)生增殖，這可能與TGF-β1下游的Smads分子表達(dá)異常有關(guān)，所以TGF-β/Smads通路在腫瘤中變化比較復(fù)雜。本研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)照組Smad3為16.61±0.64，且隨著三氧化二砷作用濃度的增加表達(dá)逐漸增加，當(dāng) As2O3 為 2.5μmol/L 時(shí)，Smad3 達(dá)到（39.64±1.63），各濃度三氧化二砷作用下的Smad3表達(dá)，相比正常對(duì)照組，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)表明在體外培養(yǎng)的腸癌細(xì)胞HCT116中，隨著腫瘤細(xì)胞數(shù)目的減少和細(xì)胞活動(dòng)相對(duì)靜止期時(shí)，Smad3表達(dá)逐漸增多，提示Smad3在腫瘤早期或相對(duì)穩(wěn)定時(shí)表達(dá)較高。已有研究表明，缺乏Smad3的小鼠在幽門螺桿菌感染和炎癥反應(yīng)下更易發(fā)生結(jié)直腸癌[6]，上述研究說(shuō)明在腫瘤發(fā)展過(guò)程中，Smad3可能具有抑制腫瘤的作用，其中TGF-β1在腫瘤發(fā)展的早期具有抑制腫瘤發(fā)展的作用，也可能是通過(guò)Smad3的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在整個(gè)Smad信號(hào)通路中，除了上述調(diào)節(jié)型Smad 1，2，3等，還包括抑制型Smad 6、7，它們不直接參與信號(hào)的傳遞但對(duì)整個(gè)通路具有負(fù)調(diào)控作用。Smad7位于染色體18q21上,該位點(diǎn)等位基因的丟失見(jiàn)于多種惡性疾病,并且與死亡率高,易發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)。Smad7對(duì)TGF-B家族的信號(hào)傳遞中起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,Smad7表達(dá)的紊亂，可影響細(xì)胞對(duì) TGF-β的應(yīng)答,從而促進(jìn)細(xì)胞的惡性進(jìn)展。Nakagawa在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Smad7在胰腺癌中有較高的表達(dá),將Smad7基因轉(zhuǎn)染至胰腺癌細(xì)胞，會(huì)使其惡性度增高,裸鼠動(dòng)物模型發(fā)生腫瘤機(jī)會(huì)增加,提示 Smad7表達(dá)增高有可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[7]。同時(shí)Gulubova等[8]在142例結(jié)直腸癌患者中,110例腫瘤標(biāo)本(77.4%)中抑制性蛋白 Smad7陽(yáng)性表達(dá),119例患者(76.3%)腫瘤細(xì)胞膜上TGF-R表達(dá)陽(yáng)性。該研究中，對(duì)照組Smad7 陽(yáng)性表達(dá) (38.61±0.64，2.5)μmol/L As2O3 組則為 (20.04±0.31)，即隨著三氧化二砷對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制作用的增強(qiáng)，Smad7表達(dá)逐漸減少，各濃度三氧化二砷用藥組和對(duì)照組比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與上述研究結(jié)果類似。在該研究中可能是三氧化二砷使腫瘤細(xì)胞表達(dá)Smad7減少，進(jìn)而減弱了對(duì)TGF的反饋抑制作用，從而使TGF對(duì)其下游的Smad2,3等調(diào)控發(fā)揮作用，說(shuō)明Smad7表達(dá)的異常是腸癌的重要分子特征。

該研究中Smad3、Smad7表達(dá)在4組中均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示兩者均參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，Smad3、Smad7表達(dá)的異常很可能成為結(jié)腸癌重要的分子特征，這還待于統(tǒng)計(jì)學(xué)上的篩選和確認(rèn)，上述研究表明TGF-β/Smads信號(hào)通路可能是三氧化二砷發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)之一，上述基因只是腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡等眾多調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)中的一員，Smads與胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MAPK)通路、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等相互作用[9-11]，其間的更詳細(xì)的因果關(guān)系以及機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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