張洪濤，趙小亮，范尊曉，羅宸，朱莉，毛江川，詹曉北，毛延卿

1(江南大學(xué)生物工程學(xué)院糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島，266003)

3(江蘇瑞光生物科技有限公司，江蘇無(wú)錫214000)

4(杭州眾芝康菇生物技術(shù)有限公司，浙江杭州，310015)

香菇多糖(lentinan，簡(jiǎn)稱LNT)最初是由Chihara等人從香菇中分離得到β-1，3/6葡聚糖，因其生物活性強(qiáng)、安全性高、來(lái)源廣泛而引起人們的重視，近年來(lái)更是在國(guó)內(nèi)外形成了一股開發(fā)香菇多糖的熱潮［1－3］。武漢大學(xué)的張俐娜教授在國(guó)內(nèi)較早開展了香菇多糖的結(jié)構(gòu)與流變學(xué)特性的研究，通過(guò)采用不同的溶劑實(shí)現(xiàn)了水溶性多糖和水不溶性多糖的分離與分級(jí)制備，并對(duì)不同組分的單糖組成進(jìn)行了分析［4］，對(duì)水不溶性多糖中α-1，3葡聚糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征［5］，但是對(duì)水溶性多糖組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征方面的研究至今仍鮮有報(bào)道。

在闡明食品中功能因子的量效與構(gòu)效關(guān)系研究日益強(qiáng)化的今天，對(duì)香菇子實(shí)體中水溶性多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征將有助于深入地挖掘其功能，理解其功效機(jī)制。ZHANG等對(duì)純熱水提取的水溶性多糖進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征［6］，將其鑒定為含有 β-1，3/6 和 α-1，4/6 鍵的葡聚糖;WANG等用水提法對(duì)香菇子實(shí)體進(jìn)行提取，獲得的多糖為β-1，3/6葡聚糖［7］;Jeff等在水提的基礎(chǔ)上，用DEAE-Celluose柱子依次用水，0.5 mol/L和1 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明:水洗脫液中多糖為含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成的α-雜多糖［8］，NaCl流動(dòng)相中的多糖則為含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成的β-雜多糖［9］。大量研究表明，不同提取流程獲得的多糖，其組成有差別［3］。因此，對(duì)不同的提取流程，仍需要進(jìn)行多糖的結(jié)構(gòu)分析與表征。

課題組在進(jìn)行香菇多糖組分與組成分析過(guò)程中，主要采用了張俐娜教授所用的分離提取方法，如圖1所示。但是到目前為止，對(duì)水提取部分多糖LFI和LFII的結(jié)構(gòu)、組成進(jìn)行表征的工作仍然沒(méi)有進(jìn)行。針對(duì)這一問(wèn)題，本文主要利用IR，甲基化分析(GC-MS)和NMR技術(shù)對(duì)LFI和LFII的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征與分析。此外，考慮多糖提取液中有色素、蛋白質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、低分子量物質(zhì)等雜質(zhì)，針對(duì)這一問(wèn)題，本文也對(duì)利用不同樹脂來(lái)除去香菇中提取多糖的色素方法進(jìn)行了探索。本研究將為香菇子實(shí)體中可溶性多糖的提取、質(zhì)量控制、功能挖掘與構(gòu)效關(guān)系分析提供有用的信息與數(shù)據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 水溶性多糖的分級(jí)提取

將香菇子實(shí)體真空干燥2.5 h，然后再在常溫下進(jìn)行干燥，直到水分低于7%，用氣流粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎物直接過(guò)120目振動(dòng)篩，收集備用。水溶性多糖的提取參照Z(yǔ)HANG［5］等的方法，(1)稱取香菇多糖粉末 100 g，按 1∶20(g∶mL)溶于 0.9%NaCl水溶液中，60℃溶解12 h后8 000 r/min離心10 min，得到上清液LFⅠ;(2)沉淀按1∶20(g∶mL)比例加入到80℃水中，處理10 h后8 000 r/min離心10 min得到上清液LFⅡ。具體流程如圖1所示。

圖1 水溶性多糖的分級(jí)提取流程Fig.1 The procedure of water-soluble polysaccharides extracted from Lentinus

1.2 色素的去除

樹脂的預(yù)處理。AB-8和DA201:按1∶1.5將樹脂浸泡在95%乙醇中，24 h后裝柱水洗至無(wú)醇味。JK008:先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的HCl浸泡，12 h后裝柱洗脫至中性;再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的NaOH浸泡，12 h后洗脫至中性。

樹脂的選擇。分別量取20 mL上清液LFI和LFII，每份上清液中各加入 3 mL AB-8、DA201、JK008三種樹脂，確定了對(duì)提取液LFⅠ用6 mL AB-8樹脂/10 mL提取液，LFⅡ用2 mL AB-8樹脂/10 mL提取液進(jìn)行色素脫除。

使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法濃縮脫色素的上清液LFI和LFII。將濃縮液置于磁力攪拌器上，分別緩慢加入95%的乙醇至乙醇終體積分?jǐn)?shù)為75%，混合均勻后于4℃冰箱隔夜，4 500 r/min離心10 min，收集沉淀。將沉淀溶于水后，置于截流量為7 000 Da的透析袋中，用離子水透析，每12 h更換1次水，透析2天。將透析液減壓冷凍干燥后備用。

1.3 分子質(zhì)量分布測(cè)定

凍干后的LFI和 LFII溶于水中，配成1 mg/mL(含0.2 mol/L NaCl)溶液，經(jīng)過(guò)0.45 μm醋酸纖維素膜過(guò)濾(Whatman，Maidstone，UK)，然后用于高效凝膠色譜(HPSEC)-多角度光散射聯(lián)用 (MALLS)(DAWN HELEOSII，Wyatt Technology，USA)，SHODEX OHpak SB-803-HQ(8 mm×300 mm，Showa Denko K.K.，Tokyo，Japan)柱(SB-804-HQ 作為保護(hù)柱)于25℃進(jìn)行分離。激光光源為He-Ne laser，658 nm線性偏振激光，檢測(cè)角度18個(gè)。0.1 mol/L NaNO3(含有0.02% 的疊氮化鈉)作為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min。數(shù)據(jù)處理用Wyatt Astra software軟件。Mw(weight-average molecular weight)表示質(zhì)均分子質(zhì)量，Mn(number average molecular weight)表示數(shù)均分子量，分子質(zhì)量分布指數(shù)(polydispersity index，PDI)用Mw/Mn來(lái)計(jì)算。

1.4 多糖LFI和LFII的傅里葉變換紅外光譜(IR)分析

采用KBr圓盤法處理［10］:在紅外燈照射下，取少許多糖和3～4勺KBr(多糖∶KBr質(zhì)量比約為1∶50)于研缽中研細(xì)，取適量壓成透光薄片，上樣，使用Nicolet Nexus 470 FT-IR紅外光譜儀在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)分析，分辨率設(shè)置為32 scans/4 cm－1，分析軟件為 Omnic software(version 7.0)。

1.5 多糖LFI和 LFII的核磁共振(NMR)分析

NMR分析樣品的準(zhǔn)備:將50 mg多糖LFI和LFII分別在P2O5真空干燥箱中充分干燥后溶解于0.5 mL D2O中，真空冷凍干燥，重復(fù)3次，最后將樣品用0.5 mL DMSO－d6溶解轉(zhuǎn)移至核磁管中，在25℃下進(jìn)行一維1H-NMR分析和13C譜NMR分析，采用MestReNova軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)輔助解析。

1.6 多糖LFI和 LFII的甲基化及氣質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)分析

甲基化:充分干燥的LFI和 LFII多糖樣品2 mg置于微量反應(yīng)管中，加入攪拌子，N2保護(hù)下加入1 mL無(wú)水DMSO，超聲波助溶5 min，攪拌使其充分溶解。隨后加入處理后NaH約50 mg，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h，緩慢滴加0.5 mL CH3I反應(yīng)1 h，加入1 mL ddH2O終止反應(yīng)。向反應(yīng)混合物中加入1 mL氯仿萃取，4 500 r/min離心10 min收集氯仿層，經(jīng)減壓濃縮至干，用少量氯仿溶解轉(zhuǎn)移至安瓿瓶中干燥后中加入2 mol/L三氟乙酸振蕩溶解后于110℃水解4 h。將水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至微量反應(yīng)瓶，加入0.5 mL dd H2O完全溶解后，加入0.5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液(含0.48 mol/L NaBD4)室溫反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后加入20%的醋酸水溶液(約100 μL)至反應(yīng)液pH呈中性。反應(yīng)物經(jīng)減壓濃縮至干后于真空減壓干燥箱中干燥。再加入0.5 mL無(wú)水吡啶溶解，攪拌溶解后，加入0.5 mL乙酸酐反應(yīng)1h后，加入1 mL ddH2O淬滅，反應(yīng)物加入二氯甲烷萃取3次，合并萃取液后再用2 mL ddH2O萃取4次，棄去水相，收集二氯甲烷層，減壓濃縮至干后于真空干燥箱中干燥后備用。

GC-MS分析:樣品用適量二氯甲烷溶解后進(jìn)樣GC-MS分析。參照 CCRC(complex carbohydrate research center，http://www.ccrc.uga.edu/specdb/ms/pmaa/pframe.html)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 樹脂用量對(duì)脫色率和多糖保留率的影響

AB-8、DA201兩種樹脂的用量對(duì)香菇多糖提取液脫色率和多糖保留率的影響如圖2所示(由于JK008脫色效果極弱，數(shù)據(jù)未展示)。從圖2可以看出，與DA201樹脂相比，AB-8樹脂對(duì)提取液LFⅠ、LFⅡ中的色素吸附效果較好，AB-8對(duì)多糖的吸附率也高于DA201樹脂。優(yōu)化結(jié)果為:對(duì)提取液LFI用6 mL AB-8樹脂/10 mL提取液，LFII用2 mL AB-8樹脂/10 mL提取液進(jìn)行色素脫除，此條件下色素脫除率分別為72%和53%，多糖保留率分別為43%和62%。AB-8有著較好的脫色和脫蛋白效果。

圖2 AB-8和DA201樹脂用量不同對(duì)LFI(LF1)和LFII(LF2)中色素脫出和多糖保留的影響Fig.2 The effect of amount used AB-8 and DA201 on pigments removing and polysaccharides keeping

2.2 分子質(zhì)量分布分析

LFI和LFII分子質(zhì)量如表1所示。從表1可以看出，LFI的Mw是1.350×106g/mol，LFII的 Mw 是2.771×106g/mol。LFII的分子質(zhì)量比LFI大，這是由于LFII的提取溫度較高造成的，因?yàn)闇囟仍礁?，多糖的溶解性越好。Mw/Mn是衡量分子均一的指標(biāo)，比值接近1支鏈越少，支鏈比較多的甚至高達(dá)20～50。LFI和 LFII的Mw/Mn分別是1.010和1.029。

2.3 IR光譜分析

LFI和LFII的紅外光譜如圖3所示。圖3中在2 931 cm－1和1 362 cm－1處有2組吸收峰，該吸收峰分別代表了糖類化合物C—H伸縮振動(dòng)和變角振動(dòng)，而在3 390～3 420 cm－1吸收峰則代表了糖類化合物O—H 伸縮振動(dòng)［11］，為多糖特征吸收峰［12］，1 249 和1 643 cm－1處也為多糖的特征吸收峰，這些峰在LFI和LFII的IR圖中均可以看到，這說(shuō)明兩者均為多糖。950～1 250 cm－1有強(qiáng)吸收峰，表示其為呋喃單體，在LFI和 LFII中均可以看到，說(shuō)明LFI和LFII的單糖組成為呋喃單體類型。

表1 LFI和LFII分子量Table 1 Experimental results of the Mw and Mn of LFI and LFII at 25℃

圖3 LFI和 LFII紅外光譜Fig.3 IR spectra of LFI and LFII

1 732 cm－1處為－COOH中 C=O的特征吸收峰和1213 cm－1處－COOH中OH變角振動(dòng)吸收峰，LFI和LFII的紅外光譜中均沒(méi)有觀察的該吸收峰，這表明LFI和LFII均不含葡萄糖醛酸。810 cm－1是甘露糖特征吸收峰［12］，LFI和 LFII的IR圖譜觀察到810 cm－1，表明LFI和 LFII均含有甘露糖。

在926 cm－1、844 cm－1和822 cm－1處有吸收峰為α-(1→3)-D-葡聚糖的特征吸收［5］。920 cm－1是 α-D-葡聚糖的特征吸收峰，LFI的紅外光譜圖中觀察到927 cm－1吸收峰，這表明LFI含有α-D-葡聚糖單元。

890 cm－1處吸收是 β-吡喃糖苷鍵的特征峰［11，13－14］，從 LFII的 IR 圖中可以看到，在 889 cm－1有吸收峰，則表示LFII分子中有β-D-Glc的C—H差相異構(gòu)吸收峰，即LFII中含有β呋喃構(gòu)型糖單元。β型葡聚糖C—H直立鍵在(891±7)cm－1有弱吸收，LFII的IR圖中可以看到在921 cm－1有吸收峰表明LFII含有β-D-Glc單元。

2.4 NMR分析

LFI和 LFII樣品在 DMSO/D2O中的600 MHz1H-NMR圖譜如圖4所示。在1H-NMR圖譜中，β-鍵在4.1～4.9 ppm范圍內(nèi)有峰，而α-鍵在5.0～5.6 ppm范圍內(nèi)有峰出現(xiàn)［15］。由圖4知，LFI和 LFII均既含有β-鍵也含有α-鍵。對(duì)于13CNMR分析，C1的信號(hào)峰一般在100～104 ppm C2，C3，C4，C5和 C6的在60～80 ppm，如果含有糖蛋白則會(huì)在20～40 ppm 出現(xiàn)信號(hào)峰［16］。δ(C3)(86.7/86.8/86.9 ppm)和δ(C6)(68.8/68.9 ppm)表明多糖存在1，3-和1，6-鍵型的糖單元［17－18］，LFI 和 LFII的均含有這 2 個(gè)特征峰，這表明LFI和 LFII均含有1，3-和1，6-鍵型。

圖4LFI(a)和LFII(b)的1H-NMR圖譜Fig.4 1H-NMR chemical shifts of LFI(a)and LFII(b)

LFI和 LFII的1H-NMR譜圖如圖4所示，δ4.96 ppm為α-1Xyl的H1信號(hào)峰，δ4.72 ppm為β-1Xyl的H1信號(hào)峰，δ4.53 ppm 為β-1Glc6的H1信號(hào)峰 (參考http://cell.ccrc.uga.edu/world/xgnmr/)。

圖5LFI(a)和LFII(b)的13C-NMRFig.5 13C-NMR chemical shifts of LFI(a)and LFII(b)

LFI和LFII的13CNMR分析如圖5所示。從圖5中可以看出，LFI和LFII均含有δ103.4的信號(hào)峰，這表明兩者均含 β-鍵糖單元［19］。LFI的1H-NMR含有的 δ4.52為 β-1，3，6鍵連接的 Glc的1H 信號(hào)峰，δ4.68為β-1，3鍵連接的Glc的1H信號(hào)峰，δ4.96為α-1，6 鍵連接的 Glc的1H 信號(hào)峰［20］，δ5.22 為 α-1Glc的1H 信號(hào)峰，δ5.47 為 α-1Glc4-鍵的1H 信號(hào)峰［21］。LFII的1H-NMR 含有的 δ4.53為 β-1，3，6鍵連接的Glc的1H信號(hào)峰，δ4.68為β-1，3鍵連接的Glc的1H信號(hào)峰，δ4.96為α-1，6鍵連接的Glc的1H信號(hào)峰，δ5.22 為 α-1Glc的1H 信號(hào)峰［7］。

2.5GC-MS分析

利用改良的Hakomori方法，樣品LFI和LFII依次經(jīng)甲基化、水解、還原、乙?；筮M(jìn)行GC-MS分析所得的GC-MS圖譜如圖3所示。參照CRCC(complex carbohydrate research center，http://www.ccrc.uga.edu/specdb/ms/pmaa/pframe.html)數(shù)據(jù)庫(kù)中的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。香菇中多糖成分主要由葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖組成［4，8－9］，結(jié)合 IR 和NMR數(shù)據(jù)，樣品LFI的各單糖衍生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)如表2所示，樣品LFⅡ的各單糖衍生物質(zhì)譜數(shù)據(jù)如表3所示。1，6-Man和1，4，6-Man主要根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的香菇多糖水提取多糖中Man的鍵型為α，因而將其歸為α-1，6-Man 和 α-1，4，6-Man［9，22－23］。

3 討論

與WANG等［7］利用水提法從香菇子實(shí)體中獲得的多糖為β-1，3/6-葡聚糖不同，本研究中的所提取、獲得的水溶性多糖組份為由葡萄糖，半乳糖和甘露糖組成的雜多糖，這一結(jié)果與Jeff等的研究中關(guān)于水溶性多糖的單糖組成分析相一致［8－9］，但是在Jeff等的報(bào)道中，純水提取的多糖為 α型多糖，0.5 mol/L NaCl提取的多糖為α和β混合型多糖，本研究所獲得的LFI和LFII均為α和β混合鍵型多糖;LFI多糖組分由 α-1Man，β-1Glc，α-1Gal，β-1，3-Glc-，α-1，6-Glc-，α-1，4-Glc-和 α-1，4，6-Man-糖單元組成。LFII多糖組分由 α-1Xyl，α-1Gal，β-1Glc，β-1，3-Glc-，β-1，6-Glc-，α-1，6-Man-，β-1，3，6-Glc，α-1，4，6-Man-和 α-1，2，6-Gal-糖單元組成。

表2 基于GC-MS技術(shù)的LFI甲基化分析Table 2 GC-MS analysis of alditol acetates of LFI

表3 基于GC-MS技術(shù)的LFII甲基化分析Table 3 GC-MS analysis of alditol acetates of LFII

［1］ Chihara G，Maeda Y，Hamuro J，et al.Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes(Berk.)sing［J］.Nature，1969，222(5194):687－688.

［2］ Shen J，Yao J-f，Tanida M，et al.An evidence-based perspective of Lentinus edodes(Shiitake mushroom)for cancer patients［M］.Springer:Evidence-based Anticancer Materia Medica，2011:303－317.

［3］ Xu X，Yan H，Tang J，et al.Polysaccharides in Lentinus edodes:Isolation，Structure，Immunomodulating activity and future prospective［J］.Crit Rev Food Sci Nutr，2014，54(4):474－487.

［4］ 張俐娜，張平義，李翔，等.香菇多糖的成分及其分子量研究［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，1998，19(9):1 513－1 517.

［5］ Zhang P，Zhang L，Cheng S.Chemical Structure and Molecular Weights of α-(1→3)-D-Glucan from Lentinus edodes［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1999，63(7):1 197－1 202.

［6］ Yu Z，Ming G，Kaiping W，et al.Structure，chain conformation and antitumor activity of a novel polysaccharide from Lentinus edodes［J］.Fitoterapia，2010，81(8):1 163－1 170.

［7］ WANG Kai-ping，WANG Jun，LI Qiang，et al.Structural differences and conformational characterization of five bioactive polysaccharides from Lentinus edodes［J］.Food Res Int，2014，62:223 －232.

［8］ Jeff I B，Yuan X，Sun L，et al.Purification and in vitro anti-proliferative effect of novel neutral polysaccharides from Lentinus edodes［J］.Int J Biol Macromol，2013，52:99－106.

［9］ Jeff I B，Li S，Peng X，et al.Purification，structural elucidation and antitumor activity of a novel mannogalactoglucan from the fruiting bodies of Lentinus edodes［J］.Fitoterapia，2013，84:338－346.

［10］ 劉美琴，李建中.香菇菌絲體多糖的分離鑒定與免疫功能研究［J］.生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào):英文版，1999，31(1):46－50.

［11］ 于廣利，王瑩，趙峽，等.一種堿溶性灰樹花菌絲體多糖GFM2A的制備和結(jié)構(gòu)表征［J］.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(1):87－91.

［12］ 孫玉軍，陳彥，王洵，等.蜜環(huán)菌胞外多糖的分離純化及其性質(zhì)研究［J］.安徽大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，29(5):87－91.

［13］ Cael J J，Koenig J L，Blackwell J.Infrared and Raman spectroscopy of carbohydrates:Part IV.Identification of configuration-and conformation-sensitive modes for d-glucose by normal coordinate analysis［J］.Carbohydr Res，1974，32(1):79－91.

［14］ Gonzaga M L C，Menezes T M，de Souza J R R，et al.Structural characterization of β glucans isolated from Agaricus blazei Murill using NMR and FTIR spectroscopy［J］.Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre，2013，2(2):152－156.

［15］ Bluhm T L，Sarko A.The triple helical structure of lentinan，a linear β-(1→ 3)-D-glucan［J］.Can J Chem，1977，55(2):293－299.

［16］ Gonzaga M L C，Ricardo N M，Heatley F，et al.Isolation and characterization of polysaccharides from Agaricus blazei Murill［J］.Carbohydr Polym，2005，60(1):43 －49.

［17］ Agrawal P K.NMR spectroscopy in the structural elucidation of oligosaccharides and glycosides［J］.Phytochemistry，1992，31(10):3 307－3 330.

［18］ Ogawa K，Ikeda Y，Umemura K.NMR analyses of oligosaccharides from a new water-absorbing polysaccharide produced by the family oxalobacteraceae［J］.Yakugaku zasshi:Journal of the Pharmaceutical Society of Japan，2009，129(4):503－512.

［19］ Spies T，Praznik W，Hofinger A，et al.The structure of the fructan sinistrin from Urginea maritima［J］.Carbohydr Res，1992，235:221－230.

［20］ Maity K，Maity S，Gantait S K，et al.Structural characterization and study of immunoenhancing and antioxidant property of a novel polysaccharide isolated from the aqueous extract of a somatic hybrid mushroom of Pleurotus florida and Calocybe indica variety APK2［J］.Int J Biol Macromol，2011，48(2):304 －310.

［21］ Mizuno T，Hagiwara T，Nakamura T，et al.Antitumor activity and some properties of water-soluble polysaccharides from"Himematsutake"，the fruiting body of Agaricus blazei Murill［J］.Agric Biol Chem，1990，54(11):2 889－2 896.

［22］ Allerhand A，Berman E.Systematic approach to the analysis of carbon-13NMR spectra of complex carbohydrates.I..alpha.-D-Mannopyranosyl residues in oligosaccharides and their implications for studies of glycoproteins and glycopeptides［J］.J Am Chem Soc，1984，106(8):2 400－2 412.

［23］ Allerhand A，Berman E.Systematic approach to the analysis of carbon-13NMR spectra of complex carbohydrates.2.Application to the high mannose glycopeptides of hen ovalbumin［J］.J Am Chem Soc，1984，106(8):2 412－2 420.