姜秀榕，吳惠亮，林標(biāo)聲

(1.龍巖學(xué)院 化學(xué)與材料學(xué)院，福建 龍巖 364000;2.龍巖學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，福建 龍巖 364000)

0 引言

膨潤(rùn)土(bentonite)的主要成分是蒙脫土(montmorillonite，MMT).蒙脫土的主要成分為蒙脫石.蒙脫土的分子式為(Al2-xMgx)Si4O10(OH)2·(M·nH2O)［1］，其中M=Na+，Ca2+，Mg2+.晶體屬單斜晶系2:1 型結(jié)構(gòu)的層狀硅酸鹽粘土礦物，厚度約為1mm.蒙脫土的單位晶胞由兩層硅氧四面體夾一層氧鋁八面體組成.四面體片由一個(gè)硅和四個(gè)氧緊密堆積，按二維面呈六角網(wǎng)連接，無(wú)限展開(kāi)所構(gòu)成;八面體片是鋁按六次配位與O 或OH 緊密堆積而成八面體沿二維面無(wú)限展開(kāi)構(gòu)成;四面體片和八面體片相結(jié)合組成層狀硅酸鹽的晶層.八面體空隙中的陽(yáng)離子為A13+離子，剩下兩個(gè)空位，為二八面體型.MMT 四面體中的Si4+常被Al3+代替，八面體中的Al3+常被Mg2+、Fe3+、Fe2+、Ni2+、Li+等代替，從而使層間產(chǎn)生弱的負(fù)電荷.特殊的結(jié)構(gòu)，使得蒙脫土具有獨(dú)特的性質(zhì)，具有較大的表面活性，較高的陽(yáng)離子交換能力.同時(shí)蒙脫土具有很強(qiáng)的離子吸附性能，因此適合作為有機(jī)無(wú)機(jī)陽(yáng)離子抗菌劑的吸附載體，所制備的抗菌劑添加在蒙脫土中可以制得長(zhǎng)效的抗菌材料及制品，具有廣泛的應(yīng)用前景［2～7］.本文采用將鑭離子和季銨陽(yáng)離子依次插入蒙脫土層間的方法，希望能夠制得一款抗菌譜較廣、穩(wěn)定性好的新型復(fù)合抗菌劑，進(jìn)而探究其抗菌性能.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 儀器

DX-2700 型X 射線衍射儀(丹東方圓儀器有限公司);DF-101S 集熱式電動(dòng)加熱磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠);GZX-GF-9053A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);FTIR-7600 紅外光譜儀(天津天光光學(xué)儀器有限公司);BS124S 電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);SHB-3 循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠).

1.1.2 試劑

氟化鈉(NaF)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、水合硝酸鑭、硝酸銀(廣東·汕頭市西隴化工廠生產(chǎn));營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌(龍巖學(xué)院生物生命科學(xué)學(xué)院提供).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 有機(jī)蒙脫土的制備流程

圖1 改性蒙脫土的制備工藝

1.2.2 精制蒙脫土

將一定量的連城膨潤(rùn)土原礦粉粉碎后置于崩解槽內(nèi)，加水制成10%左右的懸濁液，粗濾除去泥沙等雜質(zhì)后轉(zhuǎn)入靜置槽，經(jīng)5～6 h 靜置沉降分離后，于GZX-GF-9053A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱110℃干燥48 h，研磨過(guò)325 目篩，得到精制蒙脫土，裝瓶備用.

1.2.3 鈉基蒙脫土的制備

往10%精制蒙脫土礦漿溶液中加入4.2%的氟化鈉溶液，置于DF-101S 集熱式電動(dòng)加熱磁力攪拌器中，調(diào)節(jié)磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速為1800 r/min，在70℃下恒溫?cái)嚢?.5 h，過(guò)濾得到白色沉淀物.將過(guò)濾得到的白色沉淀物置于65℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中真空干燥48 h，研磨，過(guò)325 目篩，裝瓶備用.

1.3 復(fù)合抗菌劑的制備

1.3.1 載鑭蒙脫土制備

先將5 g 鈉基蒙脫土通過(guò)攪拌分散在50 mL 去離子水中得到懸浮液，再加入5 mmol 的水合硝酸鑭，置于DF-101S 集熱式電動(dòng)加熱磁力攪拌器中，于65℃下恒溫?cái)嚢? h，抽濾，得到沉淀物;用去離子水反復(fù)洗滌、過(guò)濾.將沉淀物取出置于坩堝中，于65℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中真空干燥48 h，研磨，過(guò)325目篩，即得載鑭蒙脫土(La-MMT).

1.3.2 季銨鹽與鈉基蒙脫土的離子交換

取5 g 鈉基蒙脫土通過(guò)攪拌分散于20 mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 值為7～8，加入40 mL 溶有5.5 mmol十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)的溶液.將混合物置于DF-101S 集熱式電動(dòng)加熱磁力攪拌器中80℃下恒溫反應(yīng)2 h，冷卻，用蒸餾水多次洗滌，用0.1 mmol/L的AgNO3 溶液檢查至溶液中無(wú)Br-離子.在恒溫鼓風(fēng)干燥箱中80～100℃下真空干燥烘干，研磨過(guò)325 目篩，制得十六烷基三甲基季銨鹽改性蒙脫土(CTAB-MMT).

1.3.3 季銨鹽-鑭-蒙脫土復(fù)合材料的制備

將5.0 g 載鑭蒙脫土(La-MMT)通過(guò)攪拌分散在100 mL 蒸餾水中，加入2.5 mmol 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，將混合物置于DF-101S 集熱式電動(dòng)加熱磁力攪拌器中65℃條件下恒溫?cái)嚢? h，抽濾，得到沉淀物，用蒸餾水反復(fù)洗滌、過(guò)濾，直至濾液中無(wú)Br-檢出(用0.1 mmol/L 的AgNO3溶液檢驗(yàn))，然后在恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，65℃條件下真空干燥48 h.研磨，過(guò)325 目篩，即得十六烷基三甲基季銨鹽-鑭-蒙脫土復(fù)合材料(CTAB-La-MMT).

1.4 結(jié)構(gòu)與成分表征

XRD 測(cè)試分析:使用DX-2700 型X-射線衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行分析，Cu Ка 射線，λ=0.15418 nm，管電壓35 KV，管電流30 mA，掃描速度為0.03°/ min，掃描范圍2θ 為2°～10°，蒙脫土層間距由Bragg 方程計(jì)算.

紅外光譜分析:使用FTIR-7600 紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行紅外光譜分析，光譜范圍0-4500 cm-1.

1.5 抗菌活性測(cè)試

1.5.1 抑菌環(huán)試驗(yàn)

抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［8］進(jìn)行.將直徑90 mm 玻璃培養(yǎng)皿及配好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基放在高溫滅菌鍋中，0.15 MPa 下滅菌20 min.待高溫滅菌后的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基自然冷卻至50℃左右，在無(wú)菌操作臺(tái)中倒平板固化.待固化約10 min 中后，用移液槍分別取適量金黃色葡萄球菌(Stapyloccus.aureus)和大腸桿菌菌(Escherichia.coli)菌液(0.2 mL，濃度約為1 ×106cfu/mL)注入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用涂布器涂布均勻.將直徑5 mm 的濾紙圓片置于15 mL Na-MMT 溶液中浸泡20 min，晾干，制成圓形片劑.將制得的圓形片劑置于平板中央，分別作3 組平行實(shí)驗(yàn).然后將培養(yǎng)皿置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.用游標(biāo)卡尺測(cè)量試樣周?chē)囊志Φ拇笮?以抑菌圈直徑的平均值作為材料抗菌性能的評(píng)價(jià)依據(jù).

同樣，對(duì)La-MMT、CTAB-MMT 和CTAB-La-MMT 做相同抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn).

1.5.2 最小抑菌濃度(MIC)的測(cè)定

將玻璃培養(yǎng)皿及配好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基在高溫滅菌鍋中，0.15 MPa 下滅菌20 min.將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分別盛放在相應(yīng)編號(hào)的錐形瓶中，于50℃條件下恒溫水浴中保溫.分別取6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1mg Na-MMT 加適量水溶解成相應(yīng)濃度的漿液與瓊脂培養(yǎng)基充分振動(dòng)混合均勻.在無(wú)菌操作臺(tái)中，將加入改性蒙脫土的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒平板固化.用移液槍將事先調(diào)配好的金黃色葡萄球菌(Staphyloccus.aureus)和大腸桿菌菌(Escherichia.coli)菌液菌液約0.2 mL注入倒好的平板中，用涂布器均勻涂布.另外，取菌液約0.2 mL 均勻涂布在未加入載鈉蒙脫土的培養(yǎng)基上，做陽(yáng)性對(duì)照.然后將培養(yǎng)皿置于37℃的霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察.

同樣，對(duì)La-MMT、CTAB-MMT 和CTAB-La-MMT 做相同的最小抑菌濃度測(cè)試實(shí)驗(yàn).

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 蒙脫土的X-射線衍射(XRD)分析

本文采用XRD 對(duì)無(wú)機(jī)蒙脫土(Na-MMT)及改性蒙脫土(CTAB-MMT、La-MMT、CTAB-MMT)的層間距進(jìn)行了測(cè)定，圖3 為蒙脫土的XRD 圖譜.

根據(jù)Bragg 方程:λ=2d sin θ，式中d 為蒙脫土硅酸鹽片層之間的平均距離即(001)面的距離，θ 為半衍射角，λ 為入射X-射線波長(zhǎng)，λ=0.154 nm.

由公式可以計(jì)算出蒙脫土的層面間距.

由圖2 可知，鈉基蒙脫土的2θ 為6.095°，d001面的層間距為1.448 nm，經(jīng)過(guò)表面改性后的蒙脫土的2θ 均向小角度方向偏移，分別偏移到5.887°，4.387°和4.762°，面間距分別增加到1.499 nm(La-MMT)、2.012 nm(CTAB-La-MMT)和1.853 nm(CTAB-MMT).這使得三個(gè)晶片的實(shí)際層間距d(d=d001-0.96，0.96 是粘土的底面間距)由0.488 nm(Na-MMT)分別增加到0.539 nm(La-MMT)、1.052 nm(CTAB-La-MMT)和0.893 nm(CTABMMT).比較這些數(shù)據(jù)可以看到隨著改性劑的變化，層間距發(fā)生了變化.這說(shuō)明有較大的陽(yáng)離子進(jìn)入到蒙脫土的片層之間，增加了蒙脫土的片層間距，改善了蒙脫土的有序度.層間距的膨脹，使得處于層間可交換位置和晶內(nèi)孔隙位置的鑭離子，均易進(jìn)入溶液，從而表現(xiàn)出抗菌性.

圖2 各種蒙脫土的XRD 譜圖

表1 蒙脫土的層面間距

2.1.2 蒙脫土的紅外表征

圖3 是Na-MMT、La-MMT 和CTAB-MMT，CTAB-La-MMT 的紅外光譜圖.從圖3 中可以看出，Na-MMT 和改性蒙脫土的紅外光譜的共同特征是在3623 cm-1 處都有Al-O-H 的伸縮振動(dòng)和1000-1100cm-1處的Si-O-Si 的骨架振動(dòng)吸收峰，800-500 cm-1為硅氧四面體和氧鋁八面體的內(nèi)部震動(dòng).La-MMT 在2851、2937、3025cm-1處出現(xiàn)C-H 伸縮振動(dòng)峰，CTAB-La-MMT 在1475 cm-1處峰的強(qiáng)度加強(qiáng).結(jié)合CTAB-La-MMT 的XRD 譜圖，結(jié)果表明CTAB-La 已經(jīng)結(jié)合進(jìn)入到蒙脫土的層間.

圖3 各種蒙脫土的紅外光譜圖

2.2 抗菌性能研究

2.2.1 抑菌環(huán)

鈉基蒙脫土(Na-MMT)、改性蒙脫土的抑菌圈照片如圖4 所示，抑菌環(huán)直徑大小見(jiàn)表2.對(duì)于E.coli 和S.aureus，Na-MMT 樣片的周?chē)闯霈F(xiàn)明顯的抑菌圈，說(shuō)明幾乎沒(méi)有抑菌作用;而CTAB-MMT、La-MMT 和CTAB-La-MMT 樣片的周?chē)霈F(xiàn)了較為明顯的抑菌環(huán).對(duì)E.coli，CTAB-MMT、La-MMT 和CTAB-La-MMT 的抑菌圈大小分別為7 mm，8 mm，12 mm.對(duì)S.aureus，CTAB-MMT、La-MMT 和CTAB-La-MMT 的抑菌圈大小分別為12 mm，16 mm，20 mm.

對(duì)同一種細(xì)菌而言，CTAB-La-MMT 的抑菌圈大于La-MMT 和CTAB-MMT，而抗菌活性的強(qiáng)弱由抑菌環(huán)的大小決定.因此，對(duì)同一種細(xì)菌而言，CTAB-La-MMT 的抗菌活性大于La-MMT 和CTAB-MMT，這是因?yàn)閺?fù)合抗菌劑的抗菌性能與季銨鹽的烷基長(zhǎng)鏈的親油性和正電荷有關(guān)，鑭離子和季銨鹽陽(yáng)離子的協(xié)同效應(yīng)使得抗菌活性提高.而且同一種改性蒙脫土對(duì)S.aureus 的抗菌效果比E.coli 好，這是因?yàn)镋.coli 是革蘭氏陰性菌，而S.aureus 是革蘭氏陽(yáng)性菌，從細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來(lái)看，雖然革蘭氏陽(yáng)性菌具有比革蘭氏陰性菌厚的多的肽聚糖細(xì)胞壁，但其結(jié)構(gòu)粗糙，很難阻止小分子的擴(kuò)散.而革蘭式陰細(xì)菌比革蘭式陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁更復(fù)雜，且有一層像篩子一樣莢膜，抗菌活性物質(zhì)很難越過(guò)莢膜［9］，使得改性蒙脫土更易進(jìn)入S.aureus 細(xì)胞內(nèi)，顯示出較強(qiáng)的抗菌活性.

圖3 各種蒙脫土的紅外光譜圖

表2 Na-MMT 和改性蒙脫土的抑菌圈大小

2.2.2 最小抑菌濃度MIC 的測(cè)定結(jié)果

從表3 可以看出，Na-MMT 對(duì)E.coli 和S.aureus 的最低抑菌濃度均大于6400 mg/L，說(shuō)明鈉基蒙脫土的抗菌效果很差.CTAB-MMT 對(duì)E.coli和S.aureus 的最小抑菌濃度分別為1600 mg/L 和400 mg/L，相對(duì)于Na-MMT 而言，抗菌效果有所改善.La-MMT 抗菌劑對(duì)E.coli 和S.aureus 的最小抑菌濃度分別為1600 mg/L 和800 mg/L，抗菌效果相對(duì)來(lái)說(shuō)不如CTAB-MMT.而CTAB-La-MMT復(fù)合抗菌劑對(duì)E.coli 和S.aureus 的最小抑菌濃度分別為400 mg/L 和200 mg/L，其抗菌效果明顯比CTAB-MMT、La-MMT 都好.

表3 Na-MMT 和改性蒙脫土的最小抑菌濃度(MIC)

3 結(jié)論

(1)用XRD，F(xiàn)T-IR 對(duì)所合成的改性蒙脫土進(jìn)行表征，結(jié)果表明CTAB-La 已經(jīng)進(jìn)入了蒙脫土之間，其層間距達(dá)2.012 nm.

(2)通過(guò)抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)表明，CTAB-La-MMT 復(fù)合物的抗菌效果好，抗菌譜比較廣，對(duì)是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均有較好的抗菌效果，CTAB-La-MMT 復(fù)合抗菌劑對(duì)E.coli 和S.aureus 的最小抑菌濃度分別為400 mg/L 和200 mg/L，抑菌環(huán)直徑高達(dá)20.00 mm.

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