張海玉+++李常勝+++++塔娜

[摘要] 目的 探析蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4有效部位高良姜素2與中山奈素應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)的方法。方法 應(yīng)用高效液相反相色譜法，流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm，梯度洗脫（0 min～20 min，34%A→37%A；20 min～60 min，37%A），流速1.0 mL/min，色譜柱為Diamosil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30°C，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果 山柰素的線性范圍為0.01656 μg～0.1656 μg（γ=0.9999），高良姜素線性范圍為0.04 μg～0.40 μg（γ=0.9999）。重復(fù)性試驗(yàn)中，山柰素、高良姜素的平均含量分別為0.43%、1.21%；RSD分別為1.43%、0.94%；加樣回收率試驗(yàn)評(píng)估中，山柰素、高良姜素的回收率平均值分別為98.92%、99.92%，RSD為2.33%、2.09%。結(jié)論 高效液相色譜檢測(cè)法的重復(fù)性較佳，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可為蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 山柰素；高良姜素；有效部位；蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4

[中圖分類號(hào)] R29 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2014）07（b）-0130-03

述達(dá)格-4為蒙藥傳統(tǒng)配方，蒙醫(yī)中用于止痛平喘，藥物成分為100 g石菖蒲、100 g木香、200 g紫硵砂，可止痛消喘，具有鎮(zhèn)“巴達(dá)干赫依”的作用[1]。用于胃腸消化功能低下、胸肋刺痛、氣短胸悶、膈肌痙攣等臨床病癥[2]。述達(dá)格-4中主藥高良姜具有抗血栓、抗凝血、鎮(zhèn)痛、抗腹瀉、止嘔、抗?jié)兊裙δ埽S酮為其主要藥理成分[3]。本研究富集復(fù)方藥物中黃酮類成分，對(duì)其有效部位的含量應(yīng)用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，取得滿意效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 試藥與儀器

Mettler Toledo公司生產(chǎn)的AB135-S電子天平，AB135-S型超聲清洗儀，日本日立公司生產(chǎn)的LC-2000全自動(dòng)進(jìn)樣高效液相色譜儀，Agilent Chemstation，L-2455紫外檢測(cè)器。安國(guó)市康達(dá)中藥材有限公司提供蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4中各藥材，娃哈哈純凈水，乙腈為Fisher 色譜純?cè)噭渌噭榉治黾?；山柰素（批?hào)：110861-200808；中國(guó)藥品生物制品檢定所）高良姜素對(duì)照品（批號(hào)：111699-200501；中國(guó)藥品生物制品檢定所）。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液制備

于5 mL容量瓶?jī)?nèi)精密稱量2.50 mg干燥減壓后恒重的高良姜素對(duì)照品，于10 mL容量瓶?jī)?nèi)稱量2.07 mg山柰素對(duì)照品，甲醇定容混勻后，于25 mL容量瓶?jī)?nèi)分別吸取1 mL兩種對(duì)照品溶液，混合對(duì)照品濃度為0.00828 mg/ mL。

2.2 供試品溶液制備

精密稱量5 g述達(dá)格-4藥材，放入250 mL圓底燒瓶?jī)?nèi)，將50%的乙醇100 mL精密加入，進(jìn)行2次回流提取，2 h/次，用脫脂棉趁熱粗濾，將兩次提取液合并，溶劑無醇味后回收，對(duì)入蒸餾水稀釋至15 mL；經(jīng)大孔樹脂柱純化，收集乙醇洗脫液，溶劑回收，25 mL容量瓶?jī)?nèi)定容70%乙醇，搖勻，即為有效部位樣品溶液，25 mL容量瓶?jī)?nèi)吸取1 mL此溶液，定容70%乙醇，搖勻后用0.45 μm微孔濾膜濾過。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

流動(dòng)相為乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm，梯度洗脫0 min～20 min，34%A→37%A；20 min～60 min，37%A），流速1.0 mL/min，色譜柱為Diamosil C18（4.6 mm×250 mm，5μm），柱溫30°C，進(jìn)樣量20 μL。在以上色譜條件下，山柰素、高良姜素與相鄰色譜峰的分離度均≥1.5，對(duì)稱因子在0.95～1.05之間，理論板數(shù)均≥7 000。色譜圖見下圖1。

1 山奈素

2 高良姜素

圖1 對(duì)照品（ A） 及供試品（ B） 色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別取混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣2.0 μL、4.0 μL、6.0 μL、8.0 μL、10.0 μL、20.0 μL在以上色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量X（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，達(dá)到山柰素、高良姜素的回歸方程分別為：Y=6469053.8311X-1420.7869 γ=0.9999（山柰素線性方程）；Y=9011119.0984X-26100.0164 γ=0.9999（高良姜素線性方程）；山柰素的線性范圍為0.01656～0.1656 μg，高良姜素線性范圍為0.04～0.40 μg。

2.5 精密度試驗(yàn)

在以上色譜條件下，選擇同一供試品溶液連續(xù)6次進(jìn)樣，測(cè)得山柰素、高良姜素的峰面積的RSD（n=6）分別為0.90%、2.52%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

同一供試品溶液制備6份，按以上色譜條件檢測(cè)。

2.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0軟件系統(tǒng)分析所有數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。山柰素、高良姜素的平均含量分別為0.43%、1.21%；RSD分別為1.43%、0.94%，見表1。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在以上色譜條件下，同一份供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h重復(fù)進(jìn)樣，檢測(cè)山柰素、高良姜素的峰面積的RSD（n=8）分別為0.79%、2.40%，說明24 h內(nèi)供試品溶液的穩(wěn)定性較佳。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱量2.5 g述達(dá)格-4藥材6份，進(jìn)行有效部位樣品溶液制備，在25 mL容量瓶?jī)?nèi)分別吸取1 mL樣品溶液，加入0.0245 mg山柰素、0.0588 mg高良姜素標(biāo)準(zhǔn)品，25 mL容量瓶?jī)?nèi)定容70%乙醇，混勻后用0.45 μm微孔濾膜濾過，按以上色譜條件檢測(cè)，計(jì)算RSD及回收率。山柰素、高良姜素的回收率平均值分為98.92%、99.92%，RSD為2.33%、2.09%，見表2。endprint

3 樣品含量測(cè)定

取樣品3批，3份/批，按以上方法制備供試品溶液，液相色譜儀內(nèi)注入20 μL供試品溶液，記錄峰面積，藥物中山柰素、高良姜素含量測(cè)定依據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法。見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（x±s）

3討論

3.1 選擇測(cè)定波長(zhǎng)

選擇測(cè)定波長(zhǎng)時(shí)，高良姜素、山柰素分別在282 nm、286 nm、290 nm處可最大吸收[4]，但經(jīng)研究二者在286 nm處吸收效果最佳[5]，所以測(cè)定波長(zhǎng)選定為286 nm。

3.2 選擇流動(dòng)相

在對(duì)流動(dòng)相的系統(tǒng)選擇中，高良姜素在乙腈—磷酸水系統(tǒng)中的分離效果較佳[6]。

3.3 選擇對(duì)照品

分析對(duì)照樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃酮為復(fù)方述達(dá)格—4有效部位的主要藥理成分，山柰素、高良姜素的藥理活性較強(qiáng)[7]。山柰素可發(fā)揮抗變態(tài)反應(yīng)、抗炎功能，影響人胃癌細(xì)胞原位移植裸鼠中的和一表達(dá)[8]；而高良姜素可顯著防護(hù)小鼠酒精型胃潰瘍及大鼠結(jié)扎性胃潰瘍，同時(shí)抗炎、抗病毒、抗畸形[9]。

該研究蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4有效部位高良姜素2與中山奈素應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)，結(jié)果顯示：重復(fù)性試驗(yàn)中，山柰素、高良姜素的平均含量分為為0.43%、1.21%；RSD分別為1.43%、0.94%；加樣回收率試驗(yàn)評(píng)估中，山柰素、高良姜素的回收率平均值分為為98.92%、99.92%，RSD為2.33%、2.09%，說明高效液相色譜檢測(cè)法的重復(fù)性較佳，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可為蒙藥復(fù)方述達(dá)格—4質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 董玉，賈鑫，馬強(qiáng).蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4不同配伍對(duì)總黃酮和高良姜素含量的影響[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，43（5）：173-174.

[2] 賈鑫，武娜，董玉.高效液相色譜法測(cè)定蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4有效部位中山奈素和高良姜素的含量[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33（3）：702-703.

[3] 梁選革，張若燕，劉莉麗.紅花注射液中槲皮素和山柰素含量的高效液相色譜測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（10）：153-156.

[4] 杜小偉，王京輝，肖斯婷，等.高效液相色譜法測(cè)定不同來源羅布麻葉中槲皮素和山柰素的含量[J].四川醫(yī)學(xué)，2010，31（5）：234-236.

[5] Brovia V，Ricciardi A，Barbeito L.N-Acetyl-aspartylglutamate （NAAG） in human cerebrospinal fluid： Determination by？high performance liquid chromatography， and influence of biological variables[J]. Amino Acidsm，2013，9（2）：175-184.

[6] 孟憲波.HPLC測(cè)定鳳眼草中槲皮素與山柰素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（8）：122-123.

[7] 吳瓊，林一帆，王常麗，等.HPLC測(cè)定冬胃顆粒中高良姜素的含量[J].中國(guó)藥師，2012，15（9）：217-218.

[8] 李建梅，霍仕霞，高莉，等.不同純度高良姜素的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（9）：164-165.

[9] 李慧，許亮，徐保利，等.HPLC測(cè)定地錦草中沒食子酸、槲皮素及山柰素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（7）：233-234.

（收稿日期：2014-04-17）endprint

3 樣品含量測(cè)定

取樣品3批，3份/批，按以上方法制備供試品溶液，液相色譜儀內(nèi)注入20 μL供試品溶液，記錄峰面積，藥物中山柰素、高良姜素含量測(cè)定依據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法。見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（x±s）

3討論

3.1 選擇測(cè)定波長(zhǎng)

選擇測(cè)定波長(zhǎng)時(shí)，高良姜素、山柰素分別在282 nm、286 nm、290 nm處可最大吸收[4]，但經(jīng)研究二者在286 nm處吸收效果最佳[5]，所以測(cè)定波長(zhǎng)選定為286 nm。

3.2 選擇流動(dòng)相

在對(duì)流動(dòng)相的系統(tǒng)選擇中，高良姜素在乙腈—磷酸水系統(tǒng)中的分離效果較佳[6]。

3.3 選擇對(duì)照品

分析對(duì)照樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃酮為復(fù)方述達(dá)格—4有效部位的主要藥理成分，山柰素、高良姜素的藥理活性較強(qiáng)[7]。山柰素可發(fā)揮抗變態(tài)反應(yīng)、抗炎功能，影響人胃癌細(xì)胞原位移植裸鼠中的和一表達(dá)[8]；而高良姜素可顯著防護(hù)小鼠酒精型胃潰瘍及大鼠結(jié)扎性胃潰瘍，同時(shí)抗炎、抗病毒、抗畸形[9]。

該研究蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4有效部位高良姜素2與中山奈素應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)，結(jié)果顯示：重復(fù)性試驗(yàn)中，山柰素、高良姜素的平均含量分為為0.43%、1.21%；RSD分別為1.43%、0.94%；加樣回收率試驗(yàn)評(píng)估中，山柰素、高良姜素的回收率平均值分為為98.92%、99.92%，RSD為2.33%、2.09%，說明高效液相色譜檢測(cè)法的重復(fù)性較佳，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可為蒙藥復(fù)方述達(dá)格—4質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

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[2] 賈鑫，武娜，董玉.高效液相色譜法測(cè)定蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4有效部位中山奈素和高良姜素的含量[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33（3）：702-703.

[3] 梁選革，張若燕，劉莉麗.紅花注射液中槲皮素和山柰素含量的高效液相色譜測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（10）：153-156.

[4] 杜小偉，王京輝，肖斯婷，等.高效液相色譜法測(cè)定不同來源羅布麻葉中槲皮素和山柰素的含量[J].四川醫(yī)學(xué)，2010，31（5）：234-236.

[5] Brovia V，Ricciardi A，Barbeito L.N-Acetyl-aspartylglutamate （NAAG） in human cerebrospinal fluid： Determination by？high performance liquid chromatography， and influence of biological variables[J]. Amino Acidsm，2013，9（2）：175-184.

[6] 孟憲波.HPLC測(cè)定鳳眼草中槲皮素與山柰素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（8）：122-123.

[7] 吳瓊，林一帆，王常麗，等.HPLC測(cè)定冬胃顆粒中高良姜素的含量[J].中國(guó)藥師，2012，15（9）：217-218.

[8] 李建梅，霍仕霞，高莉，等.不同純度高良姜素的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（9）：164-165.

[9] 李慧，許亮，徐保利，等.HPLC測(cè)定地錦草中沒食子酸、槲皮素及山柰素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（7）：233-234.

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3 樣品含量測(cè)定

取樣品3批，3份/批，按以上方法制備供試品溶液，液相色譜儀內(nèi)注入20 μL供試品溶液，記錄峰面積，藥物中山柰素、高良姜素含量測(cè)定依據(jù)外標(biāo)一點(diǎn)法。見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（x±s）

3討論

3.1 選擇測(cè)定波長(zhǎng)

選擇測(cè)定波長(zhǎng)時(shí)，高良姜素、山柰素分別在282 nm、286 nm、290 nm處可最大吸收[4]，但經(jīng)研究二者在286 nm處吸收效果最佳[5]，所以測(cè)定波長(zhǎng)選定為286 nm。

3.2 選擇流動(dòng)相

在對(duì)流動(dòng)相的系統(tǒng)選擇中，高良姜素在乙腈—磷酸水系統(tǒng)中的分離效果較佳[6]。

3.3 選擇對(duì)照品

分析對(duì)照樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)黃酮為復(fù)方述達(dá)格—4有效部位的主要藥理成分，山柰素、高良姜素的藥理活性較強(qiáng)[7]。山柰素可發(fā)揮抗變態(tài)反應(yīng)、抗炎功能，影響人胃癌細(xì)胞原位移植裸鼠中的和一表達(dá)[8]；而高良姜素可顯著防護(hù)小鼠酒精型胃潰瘍及大鼠結(jié)扎性胃潰瘍，同時(shí)抗炎、抗病毒、抗畸形[9]。

該研究蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4有效部位高良姜素2與中山奈素應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)，結(jié)果顯示：重復(fù)性試驗(yàn)中，山柰素、高良姜素的平均含量分為為0.43%、1.21%；RSD分別為1.43%、0.94%；加樣回收率試驗(yàn)評(píng)估中，山柰素、高良姜素的回收率平均值分為為98.92%、99.92%，RSD為2.33%、2.09%，說明高效液相色譜檢測(cè)法的重復(fù)性較佳，簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可為蒙藥復(fù)方述達(dá)格—4質(zhì)量控制提供依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

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[2] 賈鑫，武娜，董玉.高效液相色譜法測(cè)定蒙藥復(fù)方述達(dá)格-4有效部位中山奈素和高良姜素的含量[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，33（3）：702-703.

[3] 梁選革，張若燕，劉莉麗.紅花注射液中槲皮素和山柰素含量的高效液相色譜測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2012，23（10）：153-156.

[4] 杜小偉，王京輝，肖斯婷，等.高效液相色譜法測(cè)定不同來源羅布麻葉中槲皮素和山柰素的含量[J].四川醫(yī)學(xué)，2010，31（5）：234-236.

[5] Brovia V，Ricciardi A，Barbeito L.N-Acetyl-aspartylglutamate （NAAG） in human cerebrospinal fluid： Determination by？high performance liquid chromatography， and influence of biological variables[J]. Amino Acidsm，2013，9（2）：175-184.

[6] 孟憲波.HPLC測(cè)定鳳眼草中槲皮素與山柰素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（8）：122-123.

[7] 吳瓊，林一帆，王常麗，等.HPLC測(cè)定冬胃顆粒中高良姜素的含量[J].中國(guó)藥師，2012，15（9）：217-218.

[8] 李建梅，霍仕霞，高莉，等.不同純度高良姜素的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（9）：164-165.

[9] 李慧，許亮，徐保利，等.HPLC測(cè)定地錦草中沒食子酸、槲皮素及山柰素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（7）：233-234.

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