李雪　馬媛春　程宗明

摘要：以抗鹽玫瑰當(dāng)年生去葉的幼嫩單芽莖段為試驗材料，建立體外無性快繁體系。結(jié)果表明，適宜玫瑰離體腋芽發(fā)芽的最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L 6-BA和MS+1.5 mg/L 6-BA；適宜叢生芽繼代增殖的最佳培養(yǎng)基配方為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA和3/4MS+0.3 mg/L IBA；適宜組培苗生根的最佳培養(yǎng)基配方為1/2MS+03 mg/L NAA，其生根率可達95%。生根苗木移栽成活率可達87%以上。該體系可以用于抗鹽玫瑰的快速大量繁殖。

關(guān)鍵詞：抗鹽玫瑰；組培快繁體系；培養(yǎng)基；萌發(fā)；繼代培養(yǎng)；生根誘導(dǎo)；移栽馴化

中圖分類號： S685.120.4+3文獻標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0050-04

收稿日期：2014-04-05

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（14）2051]。

作者簡介：李雪（1987—），女，山東德州人，碩士研究生，主要從事園藝植物生物技術(shù)研究。E-mail：smilexueok@163.com。

通信作者：程宗明，博士，教授，主要從事果實系統(tǒng)生物學(xué)研究。E-mail：zmc@njau.edu.cn。玫瑰（Rosa rugosa L.）是薔薇科薔薇屬植物，廣泛分布在東亞、歐洲和北美洲地區(qū)。它花型秀美，色彩艷麗，氣味芳香，形色俱佳。玫瑰花朵主要用于提煉香精玫瑰油，玫瑰油比等重量黃金價值還高，主要應(yīng)用于化妝品、食品、精細化工等。玫瑰花瓣還可直接被腌制成食品，作調(diào)味劑使用，同時它的干燥花蕾也是一種重要的傳統(tǒng)中藥材[1]。經(jīng)測定，玫瑰的果實中含有大量的維生素A、維生素B、維生素C，還含有10多種氨基酸、可溶性糖、生物堿和無機元素等[2-4]。常食玫瑰果可以預(yù)防冠心病、肝病、急慢性傳染病和阻止產(chǎn)生致癌物質(zhì)等。玫瑰果實還常常被用來制作成濃縮維生素制劑。此外，玫瑰還具有較強的抗逆性[5]。玫瑰種子發(fā)芽慢，扦插繁殖困難，采用組織培養(yǎng)的方法繁殖玫瑰，不但生產(chǎn)周期短，繁殖系數(shù)高，而且成本低，經(jīng)濟效益很高。江蘇省東部沿海灘涂鹽堿濃度高，極少園林和觀賞植物能夠在此生長。近幾年來，筆者試種的一些抗鹽玫瑰單株具有較強耐鹽能力，利用這些耐鹽單株建立玫瑰離體快繁體系，是實現(xiàn)良種快繁以及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的客觀需求。

1材料與方法

1.1試驗材料

該供試材料為當(dāng)年生實生苗，種子來自美國海濱，經(jīng)過3個月沙藏保存后于翌年3月初播種，其盛花期見圖1。

1.2方法

1.2.1外植體的消毒處理3月中旬從優(yōu)良健壯植株剪取當(dāng)年生枝條中段帶芽的幼嫩莖段，用毛刷蘸取洗衣粉水輕輕刷洗后，剪成5.0 cm左右莖條，再流水沖洗2 h左右。在超凈工作臺上，先將莖段用70%乙醇溶液消毒30 s，用無菌水沖洗2～3次，然后置于0.1%HgCl2溶液中消毒3～5 min，再用無菌水沖洗3～5次。用無菌濾紙吸干材料表面的水分，最后將幼嫩莖條剪切成1.0 cm左右的帶芽莖段，接種[6]。

1.2.2腋芽的萌發(fā)誘導(dǎo)將已處理的無菌莖段接種于腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。基本誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，對基本培養(yǎng)基添加不同濃度的細胞分裂素6-BA（6-benzylaminopurine，6-芐氨基腺嘌呤）、大量元素和有機元素，共組成5種配方的培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+1.5 mg/L 6-BA、MS+2.5 mg/L 6-BA、3/2MS+2.5 mg/L 6-BA、MS+2.5 mg/L 6-BA（有機元素為1.5倍）。每種培養(yǎng)基上均接種30個離體莖段，每個處理重復(fù)3次，首先暗培養(yǎng)處理5 d，以減輕外植體的褐化現(xiàn)象[7-9]，培養(yǎng)4周后統(tǒng)計腋芽萌發(fā)率。

1.2.3繼代增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)培養(yǎng)基上已經(jīng)萌發(fā)的嫩芽剪切下來轉(zhuǎn)接到繼代培養(yǎng)基上生長，共設(shè)8種繼代培養(yǎng)基：MS+ 0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+01 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA、MS+0.3 mg/L IBA、3/4MS+0.3 mg/L IBA。每種培養(yǎng)基均接種20個0.5～1.0 cm長的單芽莖段，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計莖高≥2.0 cm的苗的數(shù)量。

1.2.4生根培養(yǎng)從繼代培養(yǎng)苗中選取生長健壯的幼苗，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，共組成5種生根培養(yǎng)基：1/2MS+0.1 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L NAA、1/2MS+0.5 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L IBA、1/2MS+0.4 mg/L IBA。每種培養(yǎng)基均接種20個幼苗，每個處理重復(fù)3次，接種20 d后統(tǒng)計幼苗的生根情況。

1.2.5組培苗的馴化移栽

1.2.5.1組培苗的馴化將長勢良好、株高5.0 cm以上的生根組培苗的瓶蓋擰松，放置5 d后開始每天倒入約3 mm厚的無菌水并逐漸開蓋，7 d后時徹底揭開瓶蓋，在持續(xù)該環(huán)境下觀察3 d。擰松瓶蓋后須每天添加無菌水，這樣不但能夠防止培養(yǎng)基被徹底風(fēng)干，還能為組培苗補充適當(dāng)?shù)乃帧?/p>

1.2.5.2組培苗的移栽將長勢依舊健壯且無污染的幼苗用鑷子從組培瓶中小心取出，再用無菌水輕輕將附著的培養(yǎng)基洗掉，注意不要傷根。同時剪掉幼苗基部葉片，僅保留頂端3～5張復(fù)葉，再移栽到光照培養(yǎng)箱中。移栽所用的基質(zhì)先121 ℃、30 min高壓蒸汽滅菌，基質(zhì)中蛭石 ∶草炭土 ∶珍珠巖為9 ∶3 ∶1.5，移栽完畢后澆透水，并用0.1%多菌靈溶液噴霧保苗。培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為22 ℃，晝夜溫差2～3 ℃，相對濕度為90%，光照強度為100 μmol/（m2·s），光照時間為12 h/d，其間噴水2～3次/d，同時注意防治病菌。移栽5 d后可以增加光照強度并且適當(dāng)降低澆水量[10]。

1.2.6統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)分析采用Excel和SPSS軟件進行。

2結(jié)果與分析

2.1離體芽的誘導(dǎo)

之前預(yù)試驗中采芽時間分別為3月中旬、5月中旬、7月中旬、9月中旬、10月中旬，結(jié)果以3月采芽試驗效果最好，因此正式試驗都采用3月的取樣。玫瑰離體莖段接種2周后離體芽幾乎全部萌發(fā)，但芽萌動后的生長狀況卻因培養(yǎng)基內(nèi)生長調(diào)節(jié)劑濃度的不同而表現(xiàn)出差異。由表1可以看出，MS+2.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上叢生芽少，節(jié)間極短，芽苗矮??；3/2MS+2.5 mg/L 6-BA培養(yǎng)基上分化率達157%，但節(jié)間極短；培養(yǎng)基MS+2.5 mg/L 6-BA（有機元素為1.5倍）上，叢生芽最少，節(jié)間短，芽苗矮小。以上3種培養(yǎng)基上芽苗均長勢矮壯，說明細胞分裂素6-BA濃度過高反而會抑制生長[11]，增加大量元素含量和有機元素含量也并不利于玫瑰腋芽萌發(fā)。培養(yǎng)基MS+1.5 mg/L 6-BA和MS+0.5 mg/L 6-BA上分化率都高達170%，與其他處理差異顯著，叢生芽多且生長健壯，雖然6-BA濃度為0.5 mg/L時莖稈稍細，但是并不影響其繼代生長。重復(fù)試驗篩選出適宜離體芽誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L 6-BA（圖2）和MS+1.5 mg/L 6-BA（圖3）。

2.2叢生芽的繼代培養(yǎng)

繼代增殖培養(yǎng)基采用的生長素為NAA（1-nnaphthaleneacetic acid，萘乙酸）和IBA（3-indolebutyricacid，3-吲哚丁酸）。玫瑰在8種繼代增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，芽的增殖倍數(shù)和生長情況存在差異。由表2可以看出，玫瑰在培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA上分別于3、5 d后開始出現(xiàn)葉片萎蔫現(xiàn)象，不久后死亡，說明生長素NAA和6-BA的組合并不適合這種玫瑰的繼代增殖培養(yǎng)。玫瑰在培養(yǎng)基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA上增殖倍數(shù)高達3.6，與其他處理差異顯著，叢生芽多且生長健壯；MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養(yǎng)基上叢生芽少且有畸形苗；MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基上叢生芽少，葉粗厚變脆；MS+1.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA 培養(yǎng)基上叢生芽最少，節(jié)間極短，苗叢密集，微型化。說明細胞分裂素和生長素的用量及配比對玫瑰的繼代增殖都有重要影響。MS+0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基上叢生芽較少，速度慢，個別苗生長細弱，而3/4MS+0.3 mg/L IBA培養(yǎng)基上增殖倍數(shù)高達3.8，與其他處理差異顯著，叢生芽多且生長健壯，說明調(diào)節(jié)大量元素含量可有效提高繁殖系數(shù)。重復(fù)試驗篩選出適宜玫瑰繼代增殖的培養(yǎng)基配方為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA（圖4）和3/4MS+0.3 mg/L IBA（圖5）。

2.3組培苗的生根培養(yǎng)

由表3可以明顯看出，生長素NAA較IBA對抗鹽玫瑰的組培誘導(dǎo)生根誘導(dǎo)效果更好。培養(yǎng)基1/2MS+0.1 mg/L NAA和1/2MS+0.3 mg/L IBA上組培苗生根率均為50%，平均根數(shù)分別為4條和5條，并且根系粗短；1/2MS+0.4 mg/L IBA培養(yǎng)基上組培苗生根率達75%，平均根數(shù)約為3.33條，雖然這種培養(yǎng)基比IBA濃度為0.3 mg/L時根系稍長，但由于根系細弱也不適于移栽（圖6）；在培養(yǎng)基1/2MS + 0.3 mg/L NAA和培養(yǎng)基1/2MS+0.5 mg/L NAA上，組培苗生根率均高達95%，與其他處理差異顯著，但是隨著NAA濃度升高，

平均生根數(shù)反而減少，因此NAA濃度為0.5 mg/L時并不適合誘導(dǎo)生根。

在中間繁殖體增殖到一定數(shù)量即開始進行生根培養(yǎng)，由于嫩莖中細胞分裂素的累積，在轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后增殖的趨勢往往仍然很強，幾乎沒有不定根的發(fā)生。因此，生根培養(yǎng)要降低細胞分裂素濃度，增加生長素濃度[12-13]。重復(fù)試驗篩選出誘導(dǎo)玫瑰組培苗生根的最佳培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.3 mg/L NAA（圖7），且根系良好，適于移栽。

2.4組培苗的馴化移栽

玫瑰組培苗馴化移栽15 d后，就可以過渡到正常溫室或自然條件下生長（圖8）。經(jīng)重復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)，只要按照上述程

3結(jié)論與討論

在抗鹽玫瑰的腋芽誘導(dǎo)時期，以MS+0.5 mg/L 6-BA和MS+1.5 mg/L 6-BA這2種培養(yǎng)基配方的效果最佳；在繼代與增殖時期，以MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA和3/4MS+0.3 mg/L IBA這2種培養(yǎng)基的效果最佳；在組培苗的誘導(dǎo)生根時期，以1/2MS+0.3 mg/L NAA培養(yǎng)基的效果最佳。

在玫瑰的繼代增殖培養(yǎng)階段發(fā)現(xiàn)，不同生長調(diào)節(jié)劑的配比是影響叢生芽繼代增殖的關(guān)鍵。生長素IBA與6-BA結(jié)合比NAA與6-BA結(jié)合更加適合這種玫瑰的繼代增殖培養(yǎng)。然而在玫瑰的生根培養(yǎng)中，生長素NAA卻比IBA更利于促進玫瑰的生根，應(yīng)用生長素IBA誘導(dǎo)的根普遍細弱。因此不同的生長階段對生長調(diào)節(jié)劑的需求不同。

采用組織培養(yǎng)的方法繁殖玫瑰，生產(chǎn)周期短，整個周期僅4個月，且繁殖系數(shù)高，成本低，應(yīng)有很高的經(jīng)濟效益和社會效益。另外，組培快繁技術(shù)可以保證種苗生長一致，并且能夠克服種子繁殖苗木所帶來的觀賞性狀不一致的缺點，提高苗木的商品規(guī)格，有利于進行玫瑰的工廠化生產(chǎn)，為良種快繁以及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定基礎(chǔ)。本試驗建立了抗鹽玫瑰從初代、繼代到生根離體快繁的完整體系，將為工廠化生產(chǎn)提供依據(jù)，且該試驗大量擴繁選育的抗鹽玫瑰單株，也將于江蘇省東部沿海進行區(qū)域試驗。

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