張璠等

摘要：利用細(xì)菌16S rDNA PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)，對(duì)蝦夷馬糞海膽不同腸道的微生物菌群組成進(jìn)行分析，結(jié)果表明：海膽小腸與大腸樣品分別得到14條與13條條帶，其中，共有條帶為10條，優(yōu)勢(shì)條帶分別為7條與5條，特異性條帶分別為4條與3條；經(jīng)后續(xù)條帶比較分析和DGGE圖譜割膠測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，小腸與大腸樣品中微生物主要來(lái)源于外界海水環(huán)境，其菌群構(gòu)成存在差異與蝦夷馬糞海膽消化巨藻存在不同有關(guān)。

關(guān)鍵詞：蝦夷馬糞海膽；腸道；16S rDNA；PCR-DGGE指紋圖譜

中圖分類號(hào)： S917.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0043-02

收稿日期：2013-11-22

基金項(xiàng)目：國(guó)家“863”計(jì)劃 （編號(hào)：2012AA052103）；天津市科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：12ZCZDSFO2000、12ZCZDSY12300）。

作者簡(jiǎn)介：張璠（1989—），女，天津人，碩士，從事獸醫(yī)微生物研究。E-mail：532637158@qq.com。

通信作者：李德茂。E-mail：zhangfan89@163.com。近年來(lái)，隨著化石燃料資源日趨減少及空氣污染問(wèn)題逐漸加重，可再生能源已成為世界研究熱點(diǎn)。藻類具有資源豐富、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)勢(shì)，是一種重要的潛在生物質(zhì)能源資源[1]；但是，藻類細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)復(fù)雜且難以降解[2]，大大阻礙了藻類胞內(nèi)生物能向化學(xué)能的轉(zhuǎn)變[3]，因此生產(chǎn)中迫切需要一種成本低廉且高效降解巨藻的方法。蝦夷馬糞海膽（Strongylocentyotus internedius）喜食藻類，可利用腸道微生物水解酶來(lái)水解結(jié)構(gòu)致密且多層的藻類細(xì)胞壁，達(dá)到釋放藻類細(xì)胞內(nèi)容物并吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的目的[4]，這類生物降解一般需要多種微生物協(xié)同完成，絕非一個(gè)簡(jiǎn)單過(guò)程。蝦夷馬糞海膽腸道結(jié)構(gòu)復(fù)雜，緊貼于體腔壁難以剝離，因此關(guān)于其腸道中微生物構(gòu)成及功能的研究甚少[5]。本試驗(yàn)采用PCR-DGGE技術(shù)，以16S rDNA作為分子標(biāo)記，對(duì)海膽不同腸道的微生物菌群組成進(jìn)行分析，探究不同海膽腸道微生物在巨藻（Macrocystis pyrifera）消化過(guò)程中的關(guān)系，為海膽腸道菌群動(dòng)態(tài)研究，以及體外模擬海膽腸道微生物降解巨藻以提高其胞內(nèi)物質(zhì)的化學(xué)能利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料蝦夷馬糞海膽購(gòu)買于大連太平洋海珍品有限公司；巨藻采購(gòu)于青島明月海藻集團(tuán)有限公司。

1.1.2主要試劑 TIANamp Stool DNA Kit，由天根生化科技有限公司生產(chǎn)；UNIQ-10柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒，由上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)；大量DNA產(chǎn)物純化試劑盒，由天根生化科技有限公司生產(chǎn)。

1.2樣品的處理

取形態(tài)大小正常且均一的健康海膽10只，在超凈工作臺(tái)上用70%乙醇清洗海膽表面3次；使用無(wú)菌剪刀由海膽排泄孔方向環(huán)形剪開(kāi)，用手術(shù)刀輕輕剝離海膽性腺與內(nèi)臟，將腸道完全剝離到無(wú)菌的工作盤中并清楚分段；取小腸液與大腸中的食物殘?jiān)?，裝入2 mL無(wú)菌離心管中備用。

1.3腸道DNA的提取

使用TIANamp Stool DNA Kit提取海膽大腸微生物DNA。

1.416S rDNA V3區(qū)的擴(kuò)增

1.5DGGE指紋圖譜的構(gòu)建

使用D Code 2000 System（Bio-Rad）進(jìn)行PCR-DGGE電泳。變性凝膠制備電泳條件為：10%聚丙烯酰胺，濃度范圍在30%～55%；上樣量為20 μL，電壓65 V，溫度60 ℃，電泳時(shí)間16 h。染色方法為銀染。

2結(jié)果與分析

2.1海膽腸道中細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增

將從海膽大腸、小腸中提取的微生物總DNA進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增，在230 bp左右處可見(jiàn)清晰且單一的條帶（圖1）。這表明經(jīng)擴(kuò)增后的16S rDNA V3區(qū)片段純度符合PCR-DGGE要求，可以利用16S rDNA V3區(qū)片段作為分子標(biāo)記構(gòu)建DGGE圖譜。

2.216S rDNA V3區(qū)DGGE指紋圖譜的構(gòu)建與海膽腸內(nèi)細(xì)菌組成分析

由圖2、表1可見(jiàn)，海膽小腸與大腸樣品細(xì)菌總DNA由16S rDNA V3區(qū)擴(kuò)增后經(jīng)PCR-DGGE電泳， 分別得到14條

與13條條帶，兩者條帶總數(shù)較為單一；海膽小腸樣品優(yōu)勢(shì)條帶為7條，分別為X1～X4、X7、X10和X14，其中，5種為海洋嗜冷單胞菌屬（Psychromonas sp.）細(xì)菌，2種為希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）細(xì)菌；大腸樣品優(yōu)勢(shì)條帶為5條，分別為 D1～D4、D12，其中，4種屬于嗜冷單胞菌屬細(xì)菌，1種為希瓦氏菌屬細(xì)菌；海膽小腸與大腸中特異性條帶分別為X5～X7、X9和D5、D6、D9，其中，小腸中3個(gè)條帶為海洋嗜冷單胞菌屬菌，1個(gè)為希瓦氏菌屬菌，而大腸中特異條帶均為希瓦氏菌

屬菌。這說(shuō)明海膽不同腸道中微生物類群組成存在差異。表1小腸DGGE條帶聚類分析結(jié)果

部位條帶號(hào)細(xì)菌種類相似度（%）登錄號(hào)小腸X1～X5、X8、X9、X14海洋嗜冷單胞菌屬（Psychromonas sp.）94～97NC_020802.1X6非培養(yǎng)細(xì)菌（Uncultured bacterium）——X7、X10～X13希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）100NC_008577.1大腸D1～D4、D7、D13 海洋嗜冷單胞菌屬（Psychromonas sp.）94～98NC_020802.1D5、D6、D8～D12希瓦氏菌屬（Shewanella sp.）99NC_008577.1

3結(jié)論與討論

海膽體腔為一個(gè)相對(duì)密閉的空間，正常海膽體內(nèi)微生物數(shù)量遠(yuǎn)少于外界環(huán)境[6]，同時(shí)，PCR-DGGE過(guò)程存在技術(shù)限制，不同微生物DNA可能會(huì)發(fā)生條帶共遷移，低豐度的菌群較難檢測(cè)出來(lái)[7]，造成DGGE圖譜條帶數(shù)量較少。這一現(xiàn)象與蝦夷馬糞海膽體腔中微生物研究結(jié)果較為相似。

海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海水中普遍存在，可分泌嗜冷酶[8]，這類酶最適反應(yīng)溫度較低，可長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定的活性且作用廣泛。目前，已從海水中分離出具纖維素酶與脂肪酶活性的嗜冷酶[9]，而纖維素與脂肪同樣也是巨藻的主要營(yíng)養(yǎng)成分[10]。蝦夷馬糞海膽中海洋嗜冷單胞菌屬微生物的出現(xiàn)，在一定程度上也說(shuō)明海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海膽消化巨藻過(guò)程中起到不可忽略的作用。希瓦氏菌屬微生物常在皺紋鮑及海蝦等海洋生物中被發(fā)現(xiàn)[11-12]，該菌屬中某些細(xì)菌可分泌多糖類與多不飽和脂肪酸等物質(zhì)，為海洋生物提供營(yíng)養(yǎng)[13]，并在海洋動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中與腸道內(nèi)的有害微生物形成拮抗關(guān)系[14]，起到抑制病原菌生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力的作用。因此，從試驗(yàn)結(jié)論看，海膽腸道菌中的海洋嗜冷單胞菌屬和希瓦氏菌屬菌有可能來(lái)源于海洋環(huán)境，并在海膽消化巨藻及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到重要作用。

海膽腸道中，小腸優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量比大腸豐富，這可能是由于在海膽消化過(guò)程中，食物首先經(jīng)過(guò)小腸，造成大部分附著在食物上的微生物隨之進(jìn)入小腸所致。在試驗(yàn)過(guò)程中，某些小腸樣品DGGE圖譜條帶在大腸樣品中觀測(cè)不到，這一結(jié)果與海參腸道的研究[15]相似，這也說(shuō)明了海膽腸道對(duì)微生物具有一定的選擇調(diào)節(jié)作用。另外，小腸中的海洋嗜冷單胞菌屬菌相對(duì)大腸來(lái)說(shuō)，為主要的特異菌群，其對(duì)巨藻的降解能力較強(qiáng)，可能對(duì)巨藻前期消化起到一定作用；大腸中的特異菌群為希瓦氏菌屬菌，可有效幫助海膽體進(jìn)一步吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并抑制大腸中有害微生物的產(chǎn)生。

總之，海膽腸道微生物是在進(jìn)食過(guò)程獲得，通過(guò)機(jī)體自身作用對(duì)腸道微生物進(jìn)行選擇與調(diào)節(jié)達(dá)到菌群的動(dòng)態(tài)平衡，并利用相對(duì)密閉的體腔空間來(lái)維持腸道內(nèi)微生物數(shù)量的穩(wěn)定。在海膽消化過(guò)程中，不同腸道中的微生物消化分工有所不同，小腸中海洋嗜冷單胞菌屬菌對(duì)巨藻進(jìn)行前期消化，大腸希瓦氏菌屬菌對(duì)巨藻營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行吸收調(diào)節(jié)。海膽腸道中微生物群類差異與海膽腸道功能密切相關(guān)，其優(yōu)勢(shì)微生物差異性將是了解海膽攝食、揭示腸道微生物協(xié)同降解巨藻機(jī)理的關(guān)鍵所在。

參考文獻(xiàn)：

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[15]孫奕，陳騳. 刺參體內(nèi)外微生物組成及其生理特性的研究[J]. 海洋與湖沼，1989，20（4）：300-307.李曉君，王紹梅，謝艷蘭，等. 農(nóng)桿菌滲透法轉(zhuǎn)化煙草條件的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）

：45-47.

海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海水中普遍存在，可分泌嗜冷酶[8]，這類酶最適反應(yīng)溫度較低，可長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定的活性且作用廣泛。目前，已從海水中分離出具纖維素酶與脂肪酶活性的嗜冷酶[9]，而纖維素與脂肪同樣也是巨藻的主要營(yíng)養(yǎng)成分[10]。蝦夷馬糞海膽中海洋嗜冷單胞菌屬微生物的出現(xiàn)，在一定程度上也說(shuō)明海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海膽消化巨藻過(guò)程中起到不可忽略的作用。希瓦氏菌屬微生物常在皺紋鮑及海蝦等海洋生物中被發(fā)現(xiàn)[11-12]，該菌屬中某些細(xì)菌可分泌多糖類與多不飽和脂肪酸等物質(zhì)，為海洋生物提供營(yíng)養(yǎng)[13]，并在海洋動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中與腸道內(nèi)的有害微生物形成拮抗關(guān)系[14]，起到抑制病原菌生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力的作用。因此，從試驗(yàn)結(jié)論看，海膽腸道菌中的海洋嗜冷單胞菌屬和希瓦氏菌屬菌有可能來(lái)源于海洋環(huán)境，并在海膽消化巨藻及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到重要作用。

海膽腸道中，小腸優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量比大腸豐富，這可能是由于在海膽消化過(guò)程中，食物首先經(jīng)過(guò)小腸，造成大部分附著在食物上的微生物隨之進(jìn)入小腸所致。在試驗(yàn)過(guò)程中，某些小腸樣品DGGE圖譜條帶在大腸樣品中觀測(cè)不到，這一結(jié)果與海參腸道的研究[15]相似，這也說(shuō)明了海膽腸道對(duì)微生物具有一定的選擇調(diào)節(jié)作用。另外，小腸中的海洋嗜冷單胞菌屬菌相對(duì)大腸來(lái)說(shuō)，為主要的特異菌群，其對(duì)巨藻的降解能力較強(qiáng)，可能對(duì)巨藻前期消化起到一定作用；大腸中的特異菌群為希瓦氏菌屬菌，可有效幫助海膽體進(jìn)一步吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并抑制大腸中有害微生物的產(chǎn)生。

總之，海膽腸道微生物是在進(jìn)食過(guò)程獲得，通過(guò)機(jī)體自身作用對(duì)腸道微生物進(jìn)行選擇與調(diào)節(jié)達(dá)到菌群的動(dòng)態(tài)平衡，并利用相對(duì)密閉的體腔空間來(lái)維持腸道內(nèi)微生物數(shù)量的穩(wěn)定。在海膽消化過(guò)程中，不同腸道中的微生物消化分工有所不同，小腸中海洋嗜冷單胞菌屬菌對(duì)巨藻進(jìn)行前期消化，大腸希瓦氏菌屬菌對(duì)巨藻營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行吸收調(diào)節(jié)。海膽腸道中微生物群類差異與海膽腸道功能密切相關(guān)，其優(yōu)勢(shì)微生物差異性將是了解海膽攝食、揭示腸道微生物協(xié)同降解巨藻機(jī)理的關(guān)鍵所在。

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[13]Weiner R M，Walch M，Labare M P，et al. Effect of biofilms of the marine bacterium Alteromonas colwelliana （LST） on set of the oysters Crassostrea gigas （Thunberg，1793） and C. virginica （Gmelin，1791）[J]. Journal of Shellfish Research，1989，8（1）：117-123.

[14]Vinderola G，Matar C，Perdigon G. Role of intestinal epithelial cells in immune effects mediated by gram-positive probiotic bacteria：Involvement of Toll-like receptors[J]. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2005，12（9）：1075-1084.

[15]孫奕，陳騳. 刺參體內(nèi)外微生物組成及其生理特性的研究[J]. 海洋與湖沼，1989，20（4）：300-307.李曉君，王紹梅，謝艷蘭，等. 農(nóng)桿菌滲透法轉(zhuǎn)化煙草條件的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）

：45-47.

海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海水中普遍存在，可分泌嗜冷酶[8]，這類酶最適反應(yīng)溫度較低，可長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定的活性且作用廣泛。目前，已從海水中分離出具纖維素酶與脂肪酶活性的嗜冷酶[9]，而纖維素與脂肪同樣也是巨藻的主要營(yíng)養(yǎng)成分[10]。蝦夷馬糞海膽中海洋嗜冷單胞菌屬微生物的出現(xiàn)，在一定程度上也說(shuō)明海洋嗜冷單胞菌屬微生物在海膽消化巨藻過(guò)程中起到不可忽略的作用。希瓦氏菌屬微生物常在皺紋鮑及海蝦等海洋生物中被發(fā)現(xiàn)[11-12]，該菌屬中某些細(xì)菌可分泌多糖類與多不飽和脂肪酸等物質(zhì)，為海洋生物提供營(yíng)養(yǎng)[13]，并在海洋動(dòng)物生長(zhǎng)過(guò)程中與腸道內(nèi)的有害微生物形成拮抗關(guān)系[14]，起到抑制病原菌生長(zhǎng)、提高機(jī)體免疫力的作用。因此，從試驗(yàn)結(jié)論看，海膽腸道菌中的海洋嗜冷單胞菌屬和希瓦氏菌屬菌有可能來(lái)源于海洋環(huán)境，并在海膽消化巨藻及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到重要作用。

海膽腸道中，小腸優(yōu)勢(shì)菌群數(shù)量比大腸豐富，這可能是由于在海膽消化過(guò)程中，食物首先經(jīng)過(guò)小腸，造成大部分附著在食物上的微生物隨之進(jìn)入小腸所致。在試驗(yàn)過(guò)程中，某些小腸樣品DGGE圖譜條帶在大腸樣品中觀測(cè)不到，這一結(jié)果與海參腸道的研究[15]相似，這也說(shuō)明了海膽腸道對(duì)微生物具有一定的選擇調(diào)節(jié)作用。另外，小腸中的海洋嗜冷單胞菌屬菌相對(duì)大腸來(lái)說(shuō)，為主要的特異菌群，其對(duì)巨藻的降解能力較強(qiáng)，可能對(duì)巨藻前期消化起到一定作用；大腸中的特異菌群為希瓦氏菌屬菌，可有效幫助海膽體進(jìn)一步吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并抑制大腸中有害微生物的產(chǎn)生。

總之，海膽腸道微生物是在進(jìn)食過(guò)程獲得，通過(guò)機(jī)體自身作用對(duì)腸道微生物進(jìn)行選擇與調(diào)節(jié)達(dá)到菌群的動(dòng)態(tài)平衡，并利用相對(duì)密閉的體腔空間來(lái)維持腸道內(nèi)微生物數(shù)量的穩(wěn)定。在海膽消化過(guò)程中，不同腸道中的微生物消化分工有所不同，小腸中海洋嗜冷單胞菌屬菌對(duì)巨藻進(jìn)行前期消化，大腸希瓦氏菌屬菌對(duì)巨藻營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行吸收調(diào)節(jié)。海膽腸道中微生物群類差異與海膽腸道功能密切相關(guān)，其優(yōu)勢(shì)微生物差異性將是了解海膽攝食、揭示腸道微生物協(xié)同降解巨藻機(jī)理的關(guān)鍵所在。

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